為確定感染性克隆質粒免疫小鼠拯救獲得的病毒量與誘導抗體之間的關系,以選擇最佳免疫劑量,本研究建立了一種快速、靈敏的TaqMan熒光定量PCR檢測方法。根據(jù)pcDNA3.1(+)-PCV1-2m-V5質粒的ORF2和V5標簽序列設計特異性引物和探針,并將該質粒作為陽性標準品,優(yōu)化熒光定量PCR條件后,按10倍倍比稀釋,建立標準曲線,進行靈敏性、特異性和穩(wěn)定性驗證;而后,應用該方法對免疫不同質粒濃度的6組小鼠,分別在免疫后1～9周進行病毒血癥檢測;同時,應用ELISA方法分別對PCV2抗體滴度進行檢測。結果表明,試驗建立的熒光定量PCR方法具有良好的靈敏性、特異性和穩(wěn)定性,檢測范圍可達1.29×10¹～1.29×10⁹拷貝/μL;病毒血癥可持續(xù)至第5周,抗體可維持至第8周。通過分析抗體滴度變化與病毒載量消長關系,確定使用200μg作為小鼠的最佳免疫劑量。本試驗為感染性克隆質粒進一步在本體動物(豬)體內評估免疫效果奠定基礎。

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 質粒、試驗動物、菌株以及病料樣品
    1.2 主要試劑與儀器
    1.3 引物探針設計與合成
    1.4 質粒標準品的制備
    1.5 反應條件的優(yōu)化
    1.6 標準曲線的構建和敏感性試驗
    1.7 特異性和重復性試驗
    1.8 PCV1-2m病毒載量及特異性抗體滴度檢測
2 結果
    2.1 反應條件優(yōu)化結果
    2.2 熒光定量PCR標準曲線的建立及敏感性試驗
    2.3 特異性和重復性檢測結果
    2.4 PCV1-2m病毒載量及特異性抗體滴度檢測結果
3 討論



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