豬流行性腹瀉病毒是造成仔豬高發(fā)病率和高死亡率的一種腸道致病性冠狀病毒,具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。引起的以水樣腹瀉、嘔吐和脫水為特征,各種年齡和不同品種的豬群都有易感性的一種急性高度接觸性的豬腸道傳染病。PABPC4(cytoplasmic poly(A)binding protein 4)是一種mRNA結(jié)合蛋白,在紅細(xì)胞分化、端粒酶活性調(diào)節(jié)和細(xì)胞生長中起重要作用。N蛋白是RNA結(jié)合蛋白,參與轉(zhuǎn)錄、翻譯和病毒組裝。實驗室前期通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)PABPC4與PEDV N蛋白互作。為進(jìn)一步探究PABPC4對冠狀病毒復(fù)制的影響,我們進(jìn)行了以下研究:1.SP1調(diào)控PABPC4的表達(dá)。通過PABPC4啟動子擴(kuò)增、雙熒光素酶試驗和熒光定量PCR等試驗,結(jié)果表明:SP1為PABPC4的轉(zhuǎn)錄因子。2.PABPC4抑制PEDV復(fù)制并通過PABPC4-MARCH8-NDP52自噬途徑降解PEDV N蛋白。第一,在Vero和LLC-PK1細(xì)胞上,過表達(dá)和干擾PABPC4并感染PEDV。試驗結(jié)果表明:PABPC4在Vero細(xì)胞和LLC-PK1細(xì)胞上能夠抑制PEDV復(fù)制。第二,通過Co-IP、激光共聚焦和GST Pull...

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【學(xué)位級別】：碩士

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圖2.1PEDV感染LLC-PK1、Vero細(xì)胞PABPC4變化量A:PEDV感染LLC-PK1細(xì)胞;B:PEDV感染Vero細(xì)胞

別收取病毒上清液，抽提RNA、反轉(zhuǎn)錄并通過qPCR的方法檢測細(xì)胞病毒上清液中PABPC4mRNA水平表達(dá)量，試驗結(jié)果顯示：與對照組相比，PEDV感染后的細(xì)胞中PABPC4的含量均表現(xiàn)出下調(diào)，其中，32hPABPC4的含量下調(diào)較顯著（圖2.1A所示）；同樣地，感染Vero細(xì)胞18h....

圖2.2PABPC4啟動子核心區(qū)域的分析

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文

圖2.3PABPC4轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測及分析

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文16為了進(jìn)一步證明SP1調(diào)控PABPC4，我們通過雙熒光素酶試驗探究SP1對PABPC4啟動子活性的影響。試驗結(jié)果表明：SP1誘導(dǎo)了含有153到1核苷酸的啟動子的更高的熒光素酶表達(dá)（圖2.5E所示，p<0.05）。通過上述一系列試驗，我們可以得出：SP1....

圖2.4豬源SP1基因擴(kuò)增M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL5000)

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文17圖2.4豬源SP1基因擴(kuò)增M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL5000)Fig.2.4AmplificationoftheSP1genesofPorcineM:DNAMarker(DL5000)圖2.5不同轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控PABPC4表達(dá)A-D:qPCR檢測內(nèi)源....

本文編號：3893904