本研究采用兔胚胎作為試驗對象，從中分離克隆出兔類ES細胞，而且系統(tǒng)地比較了不同的培養(yǎng)條件對兔類ES細胞分離培養(yǎng)的影響，并對其進行了傳代培養(yǎng)及鑒定；采用不同濃度的視黃酸(retinoic acid, RA)對分離到的兔類ES細胞向原始生殖細胞(primordial germ cells,PGCs)誘導分化效果進行了初步探討，為兔胚胎干細胞的建系及向原始生殖細胞的體外分化研究奠定了基礎。試驗主要結果如下： 1.探討超數(shù)排卵對兔胚胎體外發(fā)育能力的影響，收集自然發(fā)情和超數(shù)排卵處理配種后4d的胚胎，接種于MEF飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，以自然發(fā)情交配所得兔囊胚作為對照。結果如下：超數(shù)排卵組的胚胎貼壁率、ICM形成率和F1代形成率高于自然發(fā)情組，但沒有顯著差異(P>0.05)，兔超數(shù)排卵對兔胚胎的體外發(fā)育能力沒有顯著影響。但在干細胞克隆傳代方面差異顯著(P<0.05)。因此，為保證試驗的效率，尤其在嚴寒和酷熱的環(huán)境下，兔子自然交配不易成功，對母兔采取超排方式可獲得足夠的胚胎，但在春秋季節(jié)時獲得胚胎以自然發(fā)情交配為好，其胚胎更適宜分離胚胎干細胞。 2.探討兔胚胎的不同處理對兔胚胎克隆、傳代的影響。將...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
第一章 文獻綜述
    1 胚胎癌細胞的研究概況
    2 胚胎干細胞的研究進展
    3 小鼠 ES 細胞的研究進展
    4 人胚胎干細胞的研究概況
    5 從原始生殖細胞中分離多能性細胞系
    6 胚胎干細胞生物學特性
        6.1 胚胎干細胞的形態(tài)
        6.2 胚胎干細胞的多能性
        6.3 胚胎干細胞表面抗原標志
        6.4 維持胚胎干細胞生物學特性的分子機制及相關信號轉導通路
            6.4.1 LIF 信號通路對 ESCs 多能性的維持
            6.4.2 Nanog 對 ESCs 多能性的維持
            6.4.3 BMP 信號通路對 ESCs 多能性的維持
            6.4.4 Wnt 通路對 ESCs 多能性的維持
            6.4.5 Oct-4 與 ESCs 多能性的維持
    7 ES 細胞分離培養(yǎng)的影響因素
        7.1 胚胎質量及胚胎類型
        7.2 飼養(yǎng)層對 ES 細胞分離培養(yǎng)的影響
        7.3 培養(yǎng)基對 ES 細胞分離培養(yǎng)的影響
        7.4 添加物對 ES 細胞分離培養(yǎng)的影響
            7.4.1 血清
            7.4.2 其他添加劑
        7.5 ES 細胞傳代時間及消化液的影響
    8 ES 細胞的鑒定方法
        8.1 堿性磷酸酶活性鑒定
        8.2 轉錄因子 Oct-4 及 Nanog 的表達檢測
        8.3 核型分析
        8.4 體內分化能力鑒定
        8.5 體外分化能力鑒定
        8.6 嵌合體實驗鑒定
    9 ES 細胞體外分化的研究現(xiàn)狀
        9.1 ES 細胞分化為造血細胞
        9.2 ES 細胞分化為神經(jīng)細胞
        9.3 ES 細胞分化為肝細胞
        9.4 ES 細胞分化為心肌細胞
        9.5 ES 細胞分化為胰島細胞
        9.6 ES 細胞向雄性生殖細胞的分化
    10 ES 細胞的應用前景
    11 ES 細胞研究面臨的難題與挑戰(zhàn)
第二章 兔類 ES 細胞體外培養(yǎng)體系的優(yōu)化及鑒定
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 試驗材料
            2.1.1 試驗動物
            2.1.2 主要試劑
            2.1.3 主要儀器設備
        2.2 主要溶液的配制
            2.2.1 絲裂霉素-C
            2.2.2 1 mol/L β-巰基乙醇存儲液
            2.2.3 0.2 mol/L L-谷氨酰胺存儲液
            2.2.4 0.2%TritonX-100
            2.2.5 細胞消化液 A:0.05%胰酶+0.02% EDTA 消化液
            2.2.6 細胞消化液 B:0.25%胰酶+0.04% EDTA 消化液
            2.2.7 PMSG 注射液
            2.2.8 hCG 注射液
            2.2.9 4%多聚甲醛
            2.2.10 高糖 DMEM 培養(yǎng)液
            2.2.11 MEF 培養(yǎng)液
            2.2.12 兔類 ES 細胞培養(yǎng)液
            2.2.13 MEF 凍存液
        2.3 試驗方法
            2.3.1 小鼠胎兒成纖維細胞的分離培養(yǎng)
            2.3.2 小鼠胎兒成纖維細胞的傳代培養(yǎng)
            2.3.3 小鼠胎兒成纖維細胞的凍存與復蘇
            2.3.4 MEF 飼養(yǎng)層的制備
            2.3.5 細胞計數(shù)
            2.3.6 兔胚胎的獲取與處理
                2.3.6.1 兔胚胎的獲取
                2.3.6.2 兔胚胎的處理
            2.3.7 兔類 ES 細胞分離與傳代
                2.3.7.1 ICM 的培養(yǎng)
                2.3.7.2 兔類 ES 細胞的傳代
                2.3.7.3 兔類 ES 細胞在不同培養(yǎng)基上生長傳代情況
            2.3.8 兔類 ES 細胞的鑒定
                2.3.8.1 形態(tài)學觀察
                2.3.8.2 堿性磷酸酶染色
                2.3.8.3 免疫熒光染色
                2.3.8.4 體外分化潛能
                2.3.8.5 對多能性基因 Sox2、Nanog、GAPDH mRNA 的表達進行 RT-PCR 檢測
                2.3.8.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計
    3 結果與分析
        3.1 超排對兔胚胎貼壁和兔類 ES 細胞克隆的影響
        3.2 胚胎的不同處理方式對兔類 ES 細胞分離培養(yǎng)的影響
        3.3 兔類 ES 細胞在不同培養(yǎng)基上的生長與傳代情況
        3.4 兔類 ES 細胞經(jīng)不同傳代方法后的生長傳代情況
        3.5 兔類 ES 細胞的鑒定
            3.5.1 形態(tài)結構的鑒定
            3.5.2 堿性磷酸酶鑒定
            3.5.3 免疫熒光鑒定
            3.5.4 體外分化能力的鑒定
            3.5.5 多能性基因的鑒定
    4 討論
        4.1 超數(shù)排卵對兔囊胚貼壁和兔類 ES 細胞克隆的影響
        4.2 胚胎的不同處理方式對兔類 ES 細胞分離培養(yǎng)的影響
        4.3 兔囊胚在不同培養(yǎng)基上的生長、傳代情況
        4.4 不同傳代方法對兔類 ES 細胞分離傳代的影響
        4.5 兔類 ES 細胞鑒定
    5 小結
第三章 兔類 ES 細胞向原始生殖細胞誘導的初步探討
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 試驗材料
            2.1.1 試驗對象
            2.1.2 主要試劑與儀器
        2.2 主要試劑的配制
            2.2.1 視黃酸
            2.2.2 誘導基礎液和誘導液
        2.3 試驗方法
            2.3.1 類胚體的制作
            2.3.2 RA 體外誘導兔類 ES 細胞定向分化
            2.3.3 DNA 倍體分析
    3 結果與分析
        3.1 ES 細胞生長情況及鑒定
        3.2 ES 細胞定向誘導分化后的形態(tài)特征
        3.3 DNA 倍體分析結果
    4 討論
    5 小結
第四章 結論
參考文獻
中英文縮略語表
ABSTRACT
作者簡介



本文編號：3873672