本研究采用兔胚胎作為試驗對象，從中分離克隆出兔類ES細(xì)胞，而且系統(tǒng)地比較了不同的培養(yǎng)條件對兔類ES細(xì)胞分離培養(yǎng)的影響，并對其進行了傳代培養(yǎng)及鑒定；采用不同濃度的視黃酸(retinoic acid, RA)對分離到的兔類ES細(xì)胞向原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells,PGCs)誘導(dǎo)分化效果進行了初步探討，為兔胚胎干細(xì)胞的建系及向原始生殖細(xì)胞的體外分化研究奠定了基礎(chǔ)。試驗主要結(jié)果如下： 1.探討超數(shù)排卵對兔胚胎體外發(fā)育能力的影響，收集自然發(fā)情和超數(shù)排卵處理配種后4d的胚胎，接種于MEF飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，以自然發(fā)情交配所得兔囊胚作為對照。結(jié)果如下：超數(shù)排卵組的胚胎貼壁率、ICM形成率和F1代形成率高于自然發(fā)情組，但沒有顯著差異(P>0.05)，兔超數(shù)排卵對兔胚胎的體外發(fā)育能力沒有顯著影響。但在干細(xì)胞克隆傳代方面差異顯著(P<0.05)。因此，為保證試驗的效率，尤其在嚴(yán)寒和酷熱的環(huán)境下，兔子自然交配不易成功，對母兔采取超排方式可獲得足夠的胚胎，但在春秋季節(jié)時獲得胚胎以自然發(fā)情交配為好，其胚胎更適宜分離胚胎干細(xì)胞。 2.探討兔胚胎的不同處理對兔胚胎克隆、傳代的影響。將...

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
第一章 文獻綜述
    1 胚胎癌細(xì)胞的研究概況
    2 胚胎干細(xì)胞的研究進展
    3 小鼠 ES 細(xì)胞的研究進展
    4 人胚胎干細(xì)胞的研究概況
    5 從原始生殖細(xì)胞中分離多能性細(xì)胞系
    6 胚胎干細(xì)胞生物學(xué)特性
        6.1 胚胎干細(xì)胞的形態(tài)
        6.2 胚胎干細(xì)胞的多能性
        6.3 胚胎干細(xì)胞表面抗原標(biāo)志
        6.4 維持胚胎干細(xì)胞生物學(xué)特性的分子機制及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
            6.4.1 LIF 信號通路對 ESCs 多能性的維持
            6.4.2 Nanog 對 ESCs 多能性的維持
            6.4.3 BMP 信號通路對 ESCs 多能性的維持
            6.4.4 Wnt 通路對 ESCs 多能性的維持
            6.4.5 Oct-4 與 ESCs 多能性的維持
    7 ES 細(xì)胞分離培養(yǎng)的影響因素
        7.1 胚胎質(zhì)量及胚胎類型
        7.2 飼養(yǎng)層對 ES 細(xì)胞分離培養(yǎng)的影響
        7.3 培養(yǎng)基對 ES 細(xì)胞分離培養(yǎng)的影響
        7.4 添加物對 ES 細(xì)胞分離培養(yǎng)的影響
            7.4.1 血清
            7.4.2 其他添加劑
        7.5 ES 細(xì)胞傳代時間及消化液的影響
    8 ES 細(xì)胞的鑒定方法
        8.1 堿性磷酸酶活性鑒定
        8.2 轉(zhuǎn)錄因子 Oct-4 及 Nanog 的表達檢測
        8.3 核型分析
        8.4 體內(nèi)分化能力鑒定
        8.5 體外分化能力鑒定
        8.6 嵌合體實驗鑒定
    9 ES 細(xì)胞體外分化的研究現(xiàn)狀
        9.1 ES 細(xì)胞分化為造血細(xì)胞
        9.2 ES 細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞
        9.3 ES 細(xì)胞分化為肝細(xì)胞
        9.4 ES 細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞
        9.5 ES 細(xì)胞分化為胰島細(xì)胞
        9.6 ES 細(xì)胞向雄性生殖細(xì)胞的分化
    10 ES 細(xì)胞的應(yīng)用前景
    11 ES 細(xì)胞研究面臨的難題與挑戰(zhàn)
第二章 兔類 ES 細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的優(yōu)化及鑒定
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 試驗材料
            2.1.1 試驗動物
            2.1.2 主要試劑
            2.1.3 主要儀器設(shè)備
        2.2 主要溶液的配制
            2.2.1 絲裂霉素-C
            2.2.2 1 mol/L β-巰基乙醇存儲液
            2.2.3 0.2 mol/L L-谷氨酰胺存儲液
            2.2.4 0.2%TritonX-100
            2.2.5 細(xì)胞消化液 A:0.05%胰酶+0.02% EDTA 消化液
            2.2.6 細(xì)胞消化液 B:0.25%胰酶+0.04% EDTA 消化液
            2.2.7 PMSG 注射液
            2.2.8 hCG 注射液
            2.2.9 4%多聚甲醛
            2.2.10 高糖 DMEM 培養(yǎng)液
            2.2.11 MEF 培養(yǎng)液
            2.2.12 兔類 ES 細(xì)胞培養(yǎng)液
            2.2.13 MEF 凍存液
        2.3 試驗方法
            2.3.1 小鼠胎兒成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)
            2.3.2 小鼠胎兒成纖維細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
            2.3.3 小鼠胎兒成纖維細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
            2.3.4 MEF 飼養(yǎng)層的制備
            2.3.5 細(xì)胞計數(shù)
            2.3.6 兔胚胎的獲取與處理
                2.3.6.1 兔胚胎的獲取
                2.3.6.2 兔胚胎的處理
            2.3.7 兔類 ES 細(xì)胞分離與傳代
                2.3.7.1 ICM 的培養(yǎng)
                2.3.7.2 兔類 ES 細(xì)胞的傳代
                2.3.7.3 兔類 ES 細(xì)胞在不同培養(yǎng)基上生長傳代情況
            2.3.8 兔類 ES 細(xì)胞的鑒定
                2.3.8.1 形態(tài)學(xué)觀察
                2.3.8.2 堿性磷酸酶染色
                2.3.8.3 免疫熒光染色
                2.3.8.4 體外分化潛能
                2.3.8.5 對多能性基因 Sox2、Nanog、GAPDH mRNA 的表達進行 RT-PCR 檢測
                2.3.8.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計
    3 結(jié)果與分析
        3.1 超排對兔胚胎貼壁和兔類 ES 細(xì)胞克隆的影響
        3.2 胚胎的不同處理方式對兔類 ES 細(xì)胞分離培養(yǎng)的影響
        3.3 兔類 ES 細(xì)胞在不同培養(yǎng)基上的生長與傳代情況
        3.4 兔類 ES 細(xì)胞經(jīng)不同傳代方法后的生長傳代情況
        3.5 兔類 ES 細(xì)胞的鑒定
            3.5.1 形態(tài)結(jié)構(gòu)的鑒定
            3.5.2 堿性磷酸酶鑒定
            3.5.3 免疫熒光鑒定
            3.5.4 體外分化能力的鑒定
            3.5.5 多能性基因的鑒定
    4 討論
        4.1 超數(shù)排卵對兔囊胚貼壁和兔類 ES 細(xì)胞克隆的影響
        4.2 胚胎的不同處理方式對兔類 ES 細(xì)胞分離培養(yǎng)的影響
        4.3 兔囊胚在不同培養(yǎng)基上的生長、傳代情況
        4.4 不同傳代方法對兔類 ES 細(xì)胞分離傳代的影響
        4.5 兔類 ES 細(xì)胞鑒定
    5 小結(jié)
第三章 兔類 ES 細(xì)胞向原始生殖細(xì)胞誘導(dǎo)的初步探討
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 試驗材料
            2.1.1 試驗對象
            2.1.2 主要試劑與儀器
        2.2 主要試劑的配制
            2.2.1 視黃酸
            2.2.2 誘導(dǎo)基礎(chǔ)液和誘導(dǎo)液
        2.3 試驗方法
            2.3.1 類胚體的制作
            2.3.2 RA 體外誘導(dǎo)兔類 ES 細(xì)胞定向分化
            2.3.3 DNA 倍體分析
    3 結(jié)果與分析
        3.1 ES 細(xì)胞生長情況及鑒定
        3.2 ES 細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化后的形態(tài)特征
        3.3 DNA 倍體分析結(jié)果
    4 討論
    5 小結(jié)
第四章 結(jié)論
參考文獻
中英文縮略語表
ABSTRACT
作者簡介



本文編號：3873672