苦馬豆素（1，2，8-trihyroxyindolizidine，swainsonine，SW）是從豆科黃芪屬（Astrgalus）和棘豆屬（Oxytropis）等有毒植物中分離得到的一種吲哚茲定生物堿。家畜采食含有SW的植物后不僅能導(dǎo)致中毒死亡，更為嚴(yán)重的是還能引起母畜不孕或流產(chǎn)，給予畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。到目前為止，關(guān)于SW是如何引起妊娠母畜流產(chǎn)的分子機(jī)制還不清楚。近年來的研究顯示，許多有毒物質(zhì)是通過誘導(dǎo)黃體細(xì)胞凋亡來影響其孕酮分泌進(jìn)而導(dǎo)致動物不孕或流產(chǎn)。因此，本論文在建立永生化山羊黃體細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，進(jìn)行SW對山羊黃體細(xì)胞孕酮分泌的影響和SW誘導(dǎo)山羊黃體細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究，以期揭示SW引起妊娠母畜流產(chǎn)的分子機(jī)制。研究得到以下結(jié)果： 1.采取妊娠6～8周的山羊黃體組織，用2mg/mL的膠原酶消化分離黃體細(xì)胞，離心收集消化后分散的單個細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)，用含有10%胎牛血清的DMEM/DF12培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞沉淀，置于37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種培養(yǎng)12h后細(xì)胞開始貼壁，呈梭形和多角形，為原代山羊黃體細(xì)胞。細(xì)胞化學(xué)染色顯示3β-羥基類固醇脫氫酶（3β-hydroxyst...

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【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
前言
文獻(xiàn)綜述
    第一章 黃體細(xì)胞永生化研究進(jìn)展
        1.1 黃體細(xì)胞的形態(tài)特征
        1.2 黃體細(xì)胞的功能
            1.2.1 孕酮的合成與分泌
        1.3 孕酮合成的調(diào)節(jié)
            1.3.1 促黃體激素對孕酮合成分泌的調(diào)節(jié)
            1.3.2 生長激素和胰島素生長因子-I 對孕酮合成分泌的調(diào)節(jié)
            1.3.3 前列腺素對孕酮合成分泌的影響
        1.4 原代黃體細(xì)胞的分離培養(yǎng)
            1.4.1 原代黃體細(xì)胞的增殖和衰老
            1.4.2 衰老與端粒的關(guān)系
            1.4.3 端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能
        1.5 細(xì)胞的永生化
            1.5.1 促使細(xì)胞永生的基本方法
        1.6 黃體細(xì)胞系
        1.7 端粒酶在細(xì)胞永生化中的優(yōu)越性
    第二章 植物生物堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展
        2.1 細(xì)胞凋亡
            2.1.1 凋亡與壞死
            2.1.2 細(xì)胞凋亡的特征
            2.1.3 細(xì)胞凋亡的調(diào)控
            2.1.4 Caspase 家族
            2.1.5 Bcl-2 蛋白家族
            2.1.6 線粒體相關(guān)凋亡分子
        2.2 細(xì)胞凋亡的生理意義
        2.3 細(xì)胞周期與調(diào)控
        2.4 植物生物堿誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
            2.4.1 苦參堿
            2.4.2 粉防已堿
            2.4.3 秋水仙堿
            2.4.4 石蒜堿
            2.4.5 千金藤堿
            2.4.6 喜樹堿
            2.4.7 玫瑰樹堿
        2.5 苦馬豆素
            2.5.1 苦馬豆素的來源和性質(zhì)
            2.5.2 SW 引起家畜中毒的臨床表現(xiàn)與病理變化
            2.5.3 苦馬豆素的作用
            2.5.4 苦馬豆素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用
        2.6 本研究的目的和意義
試驗研究
    第三章 永生化山羊黃體細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特征分析
        3.1 材料
            3.1.1 細(xì)胞和菌株
            3.1.2 主要試劑
            3.1.3 試驗所用溶液及其配制
            3.1.4 主要儀器
        3.2 方法
            3.2.1 山羊黃體細(xì)胞的分離培養(yǎng)
            3.2.2 黃體細(xì)胞的鑒定
            3.2.3 hTERT 基因轉(zhuǎn)染原代山羊黃體細(xì)胞
            3.2.4 黃體細(xì)胞的純化及鑒定
            3.2.5 外源性 hTERT 在轉(zhuǎn)染后黃體細(xì)胞中的表達(dá)和活性
            3.2.6 轉(zhuǎn)染后黃體細(xì)胞生物學(xué)功能的檢測
            3.2.7 轉(zhuǎn)染后黃體細(xì)胞生物學(xué)特征的檢測
            3.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析
        3.3. 結(jié)果
            3.3.1 原代黃體細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定
            3.3.2 pCI-neo-hTERT 質(zhì)粒的提取
            3.3.3 G418 對山羊黃體細(xì)胞最佳篩選濃度的確定
            3.3.4 轉(zhuǎn)染后陽性細(xì)胞的挑取
            3.3.5 黃體細(xì)胞的純化和鑒定
            3.3.6 hTERT 基因在黃體細(xì)胞中的表達(dá)和活性檢測
            3.3.7 RT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染后黃體細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵基因的表達(dá)
            3.3.8 放射免疫檢測不同刺激物對轉(zhuǎn)染后黃體細(xì)胞孕酮分泌量的影響
            3.3.9 轉(zhuǎn)染前后黃體細(xì)胞生長曲線的測定
            3.3.10 轉(zhuǎn)染前后黃體細(xì)胞凋亡檢測
            3.3.11 轉(zhuǎn)染前后黃體細(xì)胞核型分析
            3.3.12 軟瓊脂懸浮試驗
            3.3.13 裸鼠致瘤性試驗
        3.4 討論
        3.5 小結(jié)
    第四章 苦馬豆素對黃體細(xì)胞孕酮分泌和細(xì)胞活性的影響
        4.1 材料
            4.1.1 SW 與細(xì)胞株
            4.1.2 主要試劑
            4.1.3 試驗所用溶液及其配制
            4.1.4 主要儀器
        4.2 方法
            4.2.1 SW 對黃體細(xì)胞孕酮分泌的影響
            4.2.2 SW 對黃體細(xì)胞活性的影響
            4.2.3 QRT-PCR 檢測 SW 對黃體細(xì)胞內(nèi) StAR，3β-HSD 和 P450scc 表達(dá)
            4.2.4 Western blot 檢測 SW 對黃體細(xì)胞內(nèi) StAR，3β-HSD 和 P450scc 表達(dá)
            4.2.5 流式細(xì)胞儀檢測 SW 處理后黃體細(xì)胞周期分布
            4.2.6 Annexin-V FITC/PI 雙標(biāo)檢測細(xì)胞凋亡率
            4.2.7 DNA 片段化分析
            4.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析
        4.3 結(jié)果
            4.3.1 不同濃度 SW 對黃體細(xì)胞孕酮分泌的影響
            4.3.2 不同濃度 SW 對黃體細(xì)胞活性的影響
            4.3.3 建立檢測 StAR，3β-HSD 和 P450scc 基因的 QRT-PCR 方法
            4.3.4 SW 對轉(zhuǎn)染后黃體細(xì)胞內(nèi)表達(dá) StAR 的影響
            4.3.5 SW 對轉(zhuǎn)染后黃體細(xì)胞內(nèi)表達(dá) P450scc 的影響
            4.3.6 SW 對轉(zhuǎn)染后黃體細(xì)胞內(nèi)表達(dá) 3β-HSD 的影響
            4.3.7 SW 對轉(zhuǎn)染后黃體細(xì)胞周期的影響
            4.3.8 SW 對轉(zhuǎn)染后黃體細(xì)胞 G0/G1 周期蛋白的影響
            4.3.9 SW 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染后黃體細(xì)胞凋亡
        4.4 討論
        4.5 小結(jié)
    第五章 苦馬豆素誘導(dǎo)山羊黃體細(xì)胞凋亡的信號通路
        5.1 材料
            5.1.1 SW 與所使用細(xì)胞
            5.1.2 主要試劑
            5.1.3 試驗所用溶液及其配制
            5.1.4 主要儀器
        5.2 方法
            5.2.1 SW 對黃體細(xì)胞形態(tài)的影響
            5.2.2 SW 對黃體細(xì)胞內(nèi) Caspase-8，-9 和-3 的活性的影響
            5.2.3 Annexin-V FITC/PI 雙標(biāo)檢測 SW 對原代黃體細(xì)胞凋亡率的影響
            5.2.4 DNA 片段化分析
            5.2.5 Western blot 檢測
            5.2.6 QRT-PCR 檢測 SW 對黃體細(xì)胞內(nèi) Bax 和 Bcl-2 mRNA 表達(dá)的變化
            5.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析
        5.3 結(jié)果
            5.3.1 SW 對轉(zhuǎn)染后黃體細(xì)胞形態(tài)，Caspase 活性和 PARP 表達(dá)的影響
            5.3.2 Caspase 級聯(lián)反應(yīng)在 SW 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染后黃體細(xì)胞凋亡中的作用
            5.3.3 SW 對轉(zhuǎn)染后黃體細(xì)胞內(nèi) Bcl-2 和 Bax mRNA 表達(dá)的影響
            5.3.4 SW 對轉(zhuǎn)染后黃體細(xì)胞內(nèi) Fas，F(xiàn)asL，Bax 和 Bcl-2 表達(dá)的影響
            5.3.5 SW 對轉(zhuǎn)染后黃體細(xì)胞內(nèi) Bax，Cyt c，AIF 和 Smac 轉(zhuǎn)位的影響
            5.3.6 SW 對原代黃體細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用
            5.3.7 Caspase 級聯(lián)反應(yīng)在 SW 誘導(dǎo)原代黃體細(xì)胞凋亡中的作用
            5.3.8 SW 對原代黃體細(xì)胞內(nèi) Bax 和 Bcl-2 表達(dá)的影響
            5.3.9 SW 對原代黃體細(xì)胞 Cyt c 轉(zhuǎn)位的影響
        5.4 討論
        5.5 小結(jié)
結(jié)論與創(chuàng)新點
參考文獻(xiàn)
主要縮略詞和中英文對照表
致謝
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本文編號：3868398