本文關(guān)鍵詞：快速檢測TGEV和PEDV早期感染的UNDP-PCR方法的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：隨著規(guī)�；B(yǎng)豬業(yè)的迅速發(fā)展,豬病毒性腹瀉已成為影響?zhàn)B豬業(yè)的主要疫病之一。目前,危害養(yǎng)豬業(yè)的豬病毒性腹瀉疾病主要以傳染性胃腸炎和流行性腹瀉為主。而現(xiàn)今常用的檢測方法,無法在感染早期檢測到這些病毒的存在,使這類疾病缺乏有效監(jiān)控措施,進(jìn)而引起地域性的暴發(fā)性流行。同時,由于這兩種疫病在流行病學(xué)特征、臨床癥狀和病理剖檢變化等方面高度的相似性,因此它們的鑒別診斷必須借助實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)進(jìn)行。因此,建立超高敏感性的傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的早期檢測和鑒別診斷方法,將對于豬病毒性腹瀉疾病的綜合防控產(chǎn)生重大的意義。本研究擬首先通過系統(tǒng)化篩選TGEV和PEDV特異性的核酸探針,并將優(yōu)化的TGEV和PEDV探針分別標(biāo)記于磁性微粒和納米金顆粒上,用來從疑似感染豬血清或糞便樣本中高效富集病毒核酸,形成MMPs-RNA-AuNPs“三明治”樣復(fù)合物,將微弱病毒核酸信號進(jìn)一步放大,并利用特殊引物通過PCR檢測特異性DNA標(biāo)簽,進(jìn)而分別建立特異性針對TGEV和PEDV的基于納米顆粒的超敏檢測方法(Ultrasensitive nanoparticle DNA probe-based PCR assay,UNDP-PCR)。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步建立可同時檢測TGEV和PEDV的雙重UNDP-PCR檢測技術(shù)。研究工作取得如下結(jié)果:1.建立可從血液樣本中檢測TGEV的UNDP-PCR檢測方法。根據(jù)TGEV編碼復(fù)制酶蛋白的ORF1a基因保守區(qū)域,設(shè)計6段特異性核酸探針,標(biāo)記于磁性微粒表面,形成功能化磁珠MMPs-p1到p6。將功能化的磁珠與TGEV RNA在雜交緩沖液中40 oC孵育30 min,磁分離,用TGEV特異性的RT-PCR進(jìn)行檢測。然后將6段探針標(biāo)記于納米金顆粒,形成功能化AuNPs-Oligo1到Oligo6,分別與TGEV RNA在50 oC下雜交40 min,離心沉淀后用于TGEV RT-PCR檢測。研究結(jié)果表明:p1和Oligo2是具有高度特異性,富集病毒能力強(qiáng)、易于擴(kuò)增和檢測的2段探針,因此利用此2段探針分別功能化磁性微粒和納米金顆粒,建立一種特異性針對TGEV的UNDP-PCR檢測方法。研究結(jié)果表明:TGEV UNDP-PCR方法的靈敏度為20 copies/mL,是TGEV普通RT-PCR檢測方法的250倍;具有很好的重復(fù)性和很強(qiáng)的特異性,與其他病毒不會發(fā)生交叉反應(yīng)。2.在TGEV UNDP-PCR檢測方法的基礎(chǔ)上,經(jīng)過一定優(yōu)化和改進(jìn),建立了可從糞便樣本中檢測PEDV的UNDP-PCR檢測技術(shù)。首先,基于PEDV編碼復(fù)制酶蛋白基因ORF1a保守區(qū)域,依據(jù)一系列篩選標(biāo)準(zhǔn),共設(shè)計16段核酸序列。經(jīng)過探針篩選試驗(yàn)得到最優(yōu)化的兩段探針,分別標(biāo)記磁性微粒和納米金顆粒,用于特異性高效富集PEDV RNA。結(jié)果顯示,該方法靈敏度為25 copies/g,是傳統(tǒng)PEDV RT-PCR檢測方法的400倍,同時具有很強(qiáng)的特異性和重復(fù)性。利用該方法對153例臨床糞便樣本檢測,PEDV UNDP-PCR方法與普通RT-PCR方法的陽性檢出率分別為30.72%和5.88%。3.建立可在同一反應(yīng)體系中對TGEV和PEDV同時進(jìn)行快速靈敏檢測的雙重UNDP-PCR檢測方法。結(jié)果表明,該方法可以檢測到25 copies的TGEV和PEDV,其靈敏度是傳統(tǒng)雙重RT-PCR的400倍。此外該檢測系統(tǒng)具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性和特異性。綜上所述,本研究建立的TGEV UNDP-PCR檢測方法、PEDV UNDP-PCR檢測方法以及針對TGEV和PEDV的雙重UNDP-PCR檢測方法,檢測時間進(jìn)一步縮短,同時與傳統(tǒng)的其他檢測技術(shù)相比,具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),此技術(shù)方法為在臨床病變出現(xiàn)前對病原體擴(kuò)散進(jìn)行有效控制,減少疫病傳播提供了可靠的技術(shù)保證。
【關(guān)鍵詞】：豬傳染性胃腸炎病毒 豬流行性腹瀉病毒 納米顆粒 PCR
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.28
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 文獻(xiàn)綜述13-24
• 第一章 TGEV和PEDV病原特征及檢測技術(shù)研究概況13-21
• 1.1 豬傳染性胃腸炎病毒病原特征13-14
• 1.2 豬流行性腹瀉病毒病原特征14-15
• 1.3 TGEV和PEDV檢測技術(shù)研究概況15-21
• 1.3.1 病毒的分離與鑒定15-16
• 1.3.2 血清學(xué)和免疫學(xué)方法16-17
• 1.3.3 分子生物學(xué)方法17-21
• 第二章 納米顆粒在病原檢測中的應(yīng)用21-24
• 2.1 磁性微粒（MMPs）21-22
• 2.1.1 理化性質(zhì)21
• 2.1.2 MMPs在病原檢測方面的應(yīng)用21-22
• 2.2 納米金顆粒（AuNPs）22
• 2.2.1 理化性質(zhì)22
• 2.2.2 AuNPs在病原檢測方面的應(yīng)用22
• 2.3 本研究的目的與意義22-24
• 試驗(yàn)研究24-50
• 第三章 TGEV UNDP-PCR檢測方法的建立24-35
• 3.1 材料24-25
• 3.1.1 病毒和細(xì)胞24-25
• 3.1.2 主要試劑25
• 3.1.3 主要溶液25
• 3.1.4 主要儀器25
• 3.2 方法25-28
• 3.2.1 病毒核酸提取25
• 3.2.2 探針的設(shè)計與篩選25-26
• 3.2.3 TGEV特異性探針標(biāo)記的磁性微粒（MMPs）的制備26-27
• 3.2.4 TGEV特異性功能化納米金顆粒（AuNPs）的制備27
• 3.2.5 TGEV UNDP-PCR檢測流程27
• 3.2.6 TGEV定量載體的構(gòu)建27-28
• 3.2.7 TGEV定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制28
• 3.2.8 TGEV UNDP-PCR檢測方法的靈敏度，重復(fù)性和特異性28
• 3.3 結(jié)果28-33
• 3.3.1 探針的設(shè)計與優(yōu)化28-30
• 3.3.2 TGEV定量質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備30
• 3.3.3 TGEV定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制30-31
• 3.3.4 TGEV UNDP-PCR檢測方法的靈敏度分析31
• 3.3.5 TGEV UNDP-PCR檢測方法的重復(fù)性分析31-32
• 3.3.6 TGEV UNDP-PCR檢測方法的特異性分析32
• 3.3.7 TGEV UNDP-PCR檢測方法臨床初步應(yīng)用32-33
• 3.4 討論33-34
• 3.5 小結(jié)34-35
• 第四章 PEDV UNDP-PCR檢測方法的建立35-44
• 4.1 材料35
• 4.1.1 樣本35
• 4.1.2 主要試劑35
• 4.1.3 主要儀器35
• 4.2 方法35-37
• 4.2.1 PEDV UNDP-PCR探針的設(shè)計與篩選35-37
• 4.2.2 PEDV特異性探針標(biāo)記的磁性微粒（MMPs）和功能化納米金顆粒（AuNPs）的制備37
• 4.2.3 PEDV UNDP-PCR檢測流程37
• 4.2.4 PEDV定量載體的構(gòu)建37
• 4.2.5 PEDV定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制37
• 4.2.6 PEDV UNDP-PCR檢測方法的敏感性，重復(fù)性和特異性37
• 4.3 結(jié)果37-42
• 4.3.1 PEDV UNDP-PCR方法的優(yōu)化37-39
• 4.3.2 PEDV定量質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備39
• 4.3.3 PEDV定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制39-40
• 4.3.4 PEDV UNDP-PCR檢測方法的靈敏度分析40
• 4.3.5 PEDV UNDP-PCR檢測方法的重復(fù)性分析40-41
• 4.3.6 PEDV UNDP-PCR檢測方法的特異性分析41
• 4.3.7 PEDV UNDP-PCR方法臨床初步應(yīng)用41-42
• 4.4 討論42-43
• 4.5 小結(jié)43-44
• 第五章 TGEV和PEDV雙重UNDP-PCR檢測方法的建立44-50
• 5.1 材料44
• 5.1.1 樣本44
• 5.1.2 主要儀器和試劑44
• 5.2 方法44
• 5.2.1 雙重UNDP-PCR方法靈敏度44
• 5.2.2 雙重UNDP-PCR方法特異性和重復(fù)性44
• 5.3 結(jié)果44-48
• 5.3.1 雙重UNDP-PCR方法的優(yōu)化44-45
• 5.3.2 雙重UNDP-PCR檢測方法的靈敏度分析45-46
• 5.3.3 雙重UNDP-PCR方法特異性和可重復(fù)性分析46-47
• 5.3.4 雙重UNDP-PCR方法臨床初步應(yīng)用47-48
• 5.4 討論48-49
• 5.5 小結(jié)49-50
• 結(jié)論50-51
• 主要參考文獻(xiàn)51-57
• 英文縮略詞及中英文對照表57-58
• 致謝58-59
• 作者簡介59

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