發(fā)布時間：2023-08-01 17:34

　　鈣離子是生物體內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的第二信使,在頂復器原蟲鈣依賴蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases,CDPKs)作為鈣離子的重要下游信號分子在生物體調(diào)控自身代謝及其對外界環(huán)境的適應過程中發(fā)揮著重要的功能。實驗室前期對柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)CDPK4(EtCDPK4)功能進行了初步研究,發(fā)現(xiàn)該蛋白翻譯水平在裂殖子階段高表達,且與子孢子入侵宿主細胞相關(guān)。為了解EtCDPK4在蟲體入侵及發(fā)育過程中是如何發(fā)揮作用的,本文篩選了EtCDPK4的互作蛋白,對其中兩個可能與EtCDPK4相互作用的蛋白進行了驗證。1.EtCDPK4互作蛋白的篩選提取柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子總RNA,經(jīng)PolyA Ttract^?mRNA Isolation Systems III分離mRNA,利用MMLV-RT反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。LD-PCR合成雙鏈cDNA(dscDNAs)后經(jīng)純化柱純化去除200 bp以下dscDNAs。純化后的dscDNAs與pGADT7-Rec質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化Y187酵母感受態(tài)細胞,經(jīng)SD/-Leu缺陷型培養(yǎng)基培養(yǎng)...

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮略表
第1章 文獻綜述
    1.1 頂復器門原蟲Ca²⁺穩(wěn)態(tài)和儲存
    1.2 頂復器原蟲Ca²⁺傳導與功能
    1.3 頂復器原蟲Ca²⁺結(jié)合蛋白
    1.4 Ca²⁺功能
    1.5 CDPK功能
第2章 柔嫩艾美耳球蟲CDPK4互作蛋白的篩選
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 實驗動物與蟲株
        2.2.2 實驗試劑及儀器
        2.2.3 實驗所需試劑配制方法
        2.2.4 柔嫩艾美耳球蟲裂殖子的收集與純化
        2.2.5 柔嫩艾美耳球蟲裂殖子總RNA提取
        2.2.6 柔嫩艾美耳球蟲裂殖子mRNA分離
        2.2.7 柔嫩艾美耳球蟲裂殖子dscDNA合成與純化
        2.2.8 酵母感受態(tài)細胞的制備
        2.2.9 柔嫩艾美耳球蟲裂殖子Y2HcDNA文庫的構(gòu)建
        2.2.10 柔嫩艾美耳球蟲裂殖子cDNA文庫檢測
        2.2.11 pGBKT7-EtCDPK4質(zhì)粒復蘇及提取
        2.2.12 Y2H篩選EtCDPK4互作蛋白
        2.2.13 回復雜交驗證陽性質(zhì)粒
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子的收集與純化
        2.3.2 柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子總RNA提取
        2.3.3 柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子mRNA分離及雙鏈cDNA純化
        2.3.4 柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子酵母cDNA文庫構(gòu)建和質(zhì)量檢測
        2.3.5 Y2H初步篩選EtCDPK4互作蛋白
        2.3.6 回復雜交驗證
    2.4 討論
第3章 柔嫩艾美耳球蟲CDPK4兩個互作蛋白的驗證
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 實驗動物、蟲株、細胞和質(zhì)粒
        3.2.2 實驗試劑及儀器
        3.2.3 實驗所用試劑配制方法
        3.2.4 柔嫩艾美耳球蟲裂殖子、子孢子收集與純化
        3.2.5 EtSerpin、EtRPAC1及EtCDPK4基因克隆
        3.2.6 DF-1細胞復蘇與培養(yǎng)
        3.2.7 雙分子熒光互補(BiFC)實驗
        3.2.8 免疫共沉淀(Co-IP)實驗
        3.2.9 EtSerpin與EtCDPK4共定位
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 真核重組質(zhì)粒pBiFC-VC155-EtCDPK4、pBiFC-VN155-EtSerpin、pBiFC-VN155-EtRPAC1構(gòu)建
        3.3.2 真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-EtCDPK4、pcDNA3.1-flag-EtRPAC1構(gòu)建
        3.3.3 BiFC驗證蛋白互作
        3.3.4 Co-IP驗證蛋白互作
        3.3.5 EtSerpin與EtCDPK4共定位
    3.4 討論
第4章 柔嫩艾美耳球蟲RPAC1功能初步分析
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 實驗動物
        4.2.2 蟲株、載體和細胞
        4.2.3 實驗試劑及儀器
        4.2.4 基因的克隆與序列分析
        4.2.5 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2.6 融合蛋白的表達與分析
        4.2.7 融合蛋白的純化
        4.2.8 融合蛋白多克隆抗體的制備與純化
        4.2.9 蛋白免疫原性和反應原性檢測分析
        4.2.10 抗rEtRPAC1多克隆抗體體外抑制分析
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 EtRPAC1基因生物信息學分析
        4.3.2 原核重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.3 重組蛋白的誘導表達及表達形式分析
        4.3.4 重組蛋白的純化
        4.3.5 多克隆抗體的制備與純化
        4.3.6 重組蛋白免疫原性及反應原性分析
        4.3.7 體外抑制實驗
    4.4 討論
第5章 全文總結(jié)
參考文獻
作者簡介
致謝



本文編號：3838043