為研究山羊乳蛋白基因編輯,實(shí)現(xiàn)羊乳"人源化"改造。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除山羊乳中致敏原β-乳球蛋白(BLG)基因,同時(shí)在BLG基因座定點(diǎn)敲入人乳鐵蛋白(hLF)基因。針對山羊BLG基因第一外顯子設(shè)計(jì)構(gòu)建sgBLG/Cas9表達(dá)載體經(jīng)電轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞驗(yàn)證其編輯活性;將打靶載體BLC14與sgBLG/Cas9載體共轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞,經(jīng)篩選檢測獲得BLG^-/hLF⁺打靶細(xì)胞株作為供核細(xì)胞用于山羊體細(xì)胞核移植;通過剖宮產(chǎn)獲取克隆胎兒并驗(yàn)證其中靶情況。結(jié)果表明:sgBLG/Cas9編輯山羊BLG位點(diǎn)致突變率約為30%～35%;共篩選72株藥物抗性細(xì)胞株,其中有37株為基因打靶細(xì)胞,打靶效率為51.4%(37/72);挑取形態(tài)較好的7株打靶細(xì)胞用于核移植,共制備416枚重構(gòu)胚,移植30只受體山羊;30-35日齡B超診斷有13只受孕,妊娠率為43.3%(13/30);剖宮產(chǎn)獲取3只35日齡克隆胎兒均驗(yàn)證為BLG^-/hLF⁺基因型,并建立了BLG^-/hLF^+...

【文章頁數(shù)】：9 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 試驗(yàn)材料
    1.2 引物設(shè)計(jì)及合成
    1.3 sgRNA設(shè)計(jì)及sgBLG/Cas9表達(dá)載體構(gòu)建
    1.4 奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞的分離及培養(yǎng)
    1.5 CRISPR/Cas9編輯山羊BLG位點(diǎn)致突變活性檢測
    1.6 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的hLF基因打靶細(xì)胞系的建立
    1.7 轉(zhuǎn)基因克隆山羊的制備
    1.8 基因打靶克隆胎兒鑒定
2 結(jié)果與分析
    2.1 sgBLG/Cas9介導(dǎo)的山羊BLG基因座的打靶原理
    2.2 山羊胎兒成纖維細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)
    2.3 CRISPR/Cas9編輯山羊胎兒成纖維細(xì)胞的BLG位點(diǎn)活性檢測
    2.4 hLF基因打靶細(xì)胞系的檢測
    2.5 克隆胚的發(fā)育情況及基因打靶的驗(yàn)證
3 討論與結(jié)論



本文編號：3821668