黏附侵襲性大腸桿菌(adherent-invasive Escherichia coli,AIEC)與腸道感染的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),其毒力因子影響自身在腸上皮和巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活與復(fù)制,近年來(lái)受到廣泛關(guān)注的炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)可能與該致病菌密切相關(guān)。AIEC引發(fā)IBD的致病機(jī)理目前尚不明確,其鞭毛和菌毛被認(rèn)為是主要的兩大致病因子。AIEC菌株中基因fliC編碼的鞭毛蛋白是鞭毛絲的主要結(jié)構(gòu)亞基,參與細(xì)菌的一系列致病過(guò)程。Ⅰ型菌毛中fimH亞單位作為Ⅰ型菌毛的主要組成部分,在介導(dǎo)細(xì)菌黏附宿主細(xì)胞的同時(shí),為進(jìn)一步侵入機(jī)體創(chuàng)造條件。本研究以鞭毛蛋白FliC和Ⅰ型菌毛主要結(jié)構(gòu)亞單位FimH為切入點(diǎn),探究其在AIEC中所發(fā)揮的生物學(xué)作用,從而更好地理解AIEC的致病機(jī)理。首先通過(guò)比對(duì)NCBIGenBank上不同大腸桿菌E.coli菌株的E.ciku菌株的H基因序列,設(shè)計(jì)相應(yīng)的PCR引物用于擴(kuò)增檢測(cè)AIEC菌株LF82(Wild-type,083:H1)中的fliC、fimH基因,對(duì)擴(kuò)增后基因產(chǎn)物進(jìn)行純化、克隆以及序列測(cè)定。依據(jù)LF82的fliC、f...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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中文摘要
Abstract
符號(hào)說(shuō)明
文獻(xiàn)綜述 黏附侵襲性大腸桿菌鞭毛、菌毛結(jié)構(gòu)及其致病性研究進(jìn)展
    1 AIEC
    2 鞭毛、菌毛的結(jié)構(gòu)形態(tài)及相關(guān)生物學(xué)特性
    3 AIEC致病性
        3.1 生物被膜形成
        3.2 黏附、侵襲
        3.3 免疫調(diào)節(jié)
    4 其它相關(guān)毒力因子
    5 小結(jié)
    參考文獻(xiàn)
試驗(yàn)研究
    研究一、LF82鞭毛亞單位基因fliC、Ⅰ型菌毛亞單位基因fimH缺失株及相應(yīng)回補(bǔ)株的構(gòu)建
        1 材料
            1.1 菌株、質(zhì)粒
            1.2 培養(yǎng)基、主要試劑
            1.3 主要儀器
        2 方法
            2.1 fliC、fimH基因缺失引物設(shè)計(jì)
            2.2 融合PCR產(chǎn)物的制備與純化
            2.3 感受態(tài)細(xì)胞制備過(guò)程、電化學(xué)轉(zhuǎn)化過(guò)程
                2.3.1 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備
                2.3.2 質(zhì)粒pKD46的電轉(zhuǎn)化過(guò)程
                2.3.3 Red同源重組酶誘導(dǎo)、感受態(tài)細(xì)胞制備
            2.4 氯霉素抗性基因cat PCR產(chǎn)物的電轉(zhuǎn)化過(guò)程
            2.5 一次同源重組菌△fliC::cat、△fimH::cat、△fliC△fimH::cat PCR鑒定
            2.6 FLP位點(diǎn)專一性重組
            2.7 二次重組菌△fliC、△fimH、△fliC△fimH的鑒定
            2.8 回補(bǔ)株的構(gòu)建
        3 結(jié)果
            3.1 融合PCR產(chǎn)物
            3.2 一次同源重組菌△fliC::cat、△fimH:cat、△fliC△fimH::cat的PCR鑒定
            3.3 二次重組菌△fliC、△fimH、△fliC△fimH的鑒定
            3.4 回補(bǔ)株的構(gòu)建
        4 討論
        參考文獻(xiàn)
    研究二、LF82鞭毛蛋白FliC、Ⅰ型菌毛主要亞單位FimH介導(dǎo)的相關(guān)功能探索
        1 材料
            1.1 菌株、質(zhì)粒、細(xì)胞系
            1.2 主要試劑及其配用方法
            1.3 主要儀器設(shè)備
            1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2. 方法
            2.1 生長(zhǎng)曲線測(cè)定
            2.2 半固體運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)
            2.3 生物被膜定量試驗(yàn)
            2.4 Caco-2細(xì)胞黏附、侵襲試驗(yàn)
                2.4.1 Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代方法
                2.4.2 Caco-2細(xì)胞黏附試驗(yàn)
                2.4.3 Caco-2細(xì)胞侵襲試驗(yàn)
            2.5 Caco-2細(xì)胞黏附抑制試驗(yàn)
            2.6 Real-time PCR定量分析試驗(yàn)
                2.6.1 細(xì)菌總RNA的提取方法
                2.6.2 基因組DNA的去除方法
                2.6.3 反轉(zhuǎn)錄過(guò)程
                2.6.4 Real-time PCR
                2.6.5 數(shù)據(jù)的分析、處理
            2.7 小鼠腸道細(xì)菌定植試驗(yàn)
                2.7.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
                2.7.2 細(xì)菌培養(yǎng)與計(jì)數(shù)
                2.7.3 小鼠腸道細(xì)菌定植試驗(yàn)具體方法
                2.7.4 數(shù)據(jù)處理分析
        3. 結(jié)果
            3.1 生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果分析
            3.2 細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性鑒定結(jié)果
            3.3 生物被膜定量試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)分析
            3.4 Caco-2細(xì)胞黏附試驗(yàn)結(jié)果分析
            3.5 Caco-2細(xì)胞侵襲試驗(yàn)結(jié)果分析
            3.6 Caco-2細(xì)胞黏附抑制試驗(yàn)結(jié)果分析
            3.7 fliC和fimH缺失對(duì)其他毒力因子表達(dá)的影響
            3.8 小鼠腸道定植試驗(yàn)
        4 討論
        參考文獻(xiàn)
全文小結(jié)
論文創(chuàng)新點(diǎn)
致謝
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本文編號(hào)：3820018