PDK4基因是丙酮酸脫氫酶激酶家族的成員,主要在脂肪代謝、糖酵解、三羧酸循環(huán)以及ATP形成等生理過程發(fā)揮重要作用,有研究表明PDK4基因是影響家禽脂肪沉積的重要候選基因。FGF10基因是成纖維細胞生長因子家族的一員,參與多種器官的發(fā)育和成熟過程,研究表明FGF10在白色脂肪組織的發(fā)育和代謝過程中具有重要的作用。但有關(guān)于PDK4、FGF10基因在從江香豬肌內(nèi)前體脂肪細胞分化過程中是否具有調(diào)控作用尚不清楚。本研究以貴州從江香豬為試驗對象,采用分子克隆、實時熒光定量PCR、細胞培養(yǎng)、超表達和干擾等方法,闡述了PDK4、FGF10基因組織表達特性和對從江香豬肌內(nèi)前體脂肪細胞分化的影響。主要研究結(jié)果如下:1.成功克隆了從江香豬PDK4、FGF10基因CDS區(qū),生物信息學(xué)分析得知從江香豬PDK4基因的編碼區(qū)全長1224 bp,編碼407個氨基酸;FGF10基因的編碼區(qū)全長636 bp,編碼211個氨基酸。經(jīng)BLAST軟件進行同源性比對,發(fā)現(xiàn)從江香豬PDK4基因與羊、馬、人的核苷酸序列同源性分別為93%、92%、91%;FGF10基因與羊、牛、人、鼠的核苷酸序列同源性分別為94%、93%、93%、9...

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1 研究背景
        1.1 從江香豬概述
        1.2 丙酮酸脫氫酶激酶家族
        1.3 PDK4基因研究概述
            1.3.1 PDK4基因結(jié)構(gòu)特點
            1.3.2 PDK4基因的生物學(xué)功能
            1.3.3 PDK4基因在畜禽中研究現(xiàn)狀
        1.4 FGF家族研究概述
        1.5 FGF10基因研究概述
            1.5.1 FGF10基因生物學(xué)特性
            1.5.2 FGF10基因的生物學(xué)功能及研究現(xiàn)狀
        1.6 脂肪細胞分化過程關(guān)鍵調(diào)控因子
    2 本研究的目的和意義
第二章 PDK4、FGF10基因的克隆及組織表達分析
    1 試驗材料
        1.1 試驗動物與樣品
        1.2 主要試驗試劑
        1.3 試驗儀器設(shè)備
        1.4 常用試劑的配置
    2 試驗方法
        2.1 引物的設(shè)計與合成
        2.2 組織總RNA的提取
        2.3 RNA純度及濃度檢測
        2.4 合成cDNA
        2.5 PCR擴增
        2.6 PDK4、FGF10基因序列分析
        2.7 實時熒光定量PCR
        2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    3 結(jié)果與分析
        3.1 RNA純度檢測
        3.2 從江香豬PDK4、FGF10基因RT-PCR擴增結(jié)果
        3.3 從江香豬PDK4、FGF10基因測序結(jié)果分析
        3.4 從江香豬PDK4、FGF10蛋白相關(guān)生物信息學(xué)分析
        3.5 實時熒光定量PCR結(jié)果分析
            3.5.1 基因克隆
            3.5.2 qRT-PCR產(chǎn)物特異性分析
            3.5.3 不同組織中PDK4基因的表達分析
            3.5.4 不同組織中FGF10基因的表達分析
    4 討論
    5 小結(jié)
第三章 PDK4、FGF10基因的過表達載體構(gòu)建
    1 試驗材料
        1.1 試驗樣品、菌株和載體
        1.2 試驗儀器設(shè)備
        1.3 試驗試劑
        1.4 常用試劑配置
    2 試驗方法
        2.1 感受態(tài)細胞的制備
        2.2 pUCM-T-PDK4、pUCM-T-FGF10重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2.1 PDK4、FGF10基因與pUCM-T載體的連接
            2.2.2 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.2.3 重組質(zhì)粒的菌液PCR鑒定
            2.2.4 重組質(zhì)粒的提取
            2.2.5 重組質(zhì)粒的測序鑒定
            2.2.6 菌種的保存
        2.3 pEGFP-C1-PDK4、pEGFP-C1-FGF10重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.3.1 重組質(zhì)粒膠回收
            2.3.2 目的片段與pEGFP-C1載體的連接
            2.3.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.3.4 pEGFP-C1-PDK4、pEGFP-C1-FGF10重組質(zhì)粒的菌液PCR
    3 結(jié)果與分析
        3.1 重組質(zhì)粒pUCM-T-PDK4、pUCM-T-FGF10的鑒定
        3.2 重組質(zhì)粒pEGFP-C1-PDK4、pEGFP-C1-FGF10的鑒定
    4 討論
    5 小結(jié)
第四章 PDK4、FGF10基因干擾載體構(gòu)建
    1 試驗材料
        1.1 試驗材料及主要試劑
        1.2 試驗儀器設(shè)備
    2 試驗方法
        2.1 PDK4基因干擾載體的構(gòu)建
            2.1.1 寡核苷酸的設(shè)計及合成
            2.1.2 引物退火
            2.1.3 載體與siRNA的連接
            2.1.4 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及鑒定
        2.2 FGF10基因干擾載體的構(gòu)建
            2.2.1 siRNA的設(shè)計及合成
            2.2.2 引物退火
            2.2.3 載體與siRNA的連接
            2.2.4 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及鑒定
    3 結(jié)果
        3.1 pLVX-ShRNA2-puro-sPDK4載體酶切鑒定
        3.2 pLVX-ShRNA2-puro-sPDK4載體測序鑒定
        3.3 pGPU6/GFP/Neo-shRNA-sFGF10測序結(jié)果
    4 討論
    5 小結(jié)
第五章 PDK4、FGF10基因?qū)χ|(zhì)代謝的影響
    1 試驗材料
        1.1 試驗動物
        1.2 試驗儀器設(shè)備
        1.3 試驗主要試劑與器材
        1.4 主要試劑的配制
    2 試驗方法
        2.1 肌內(nèi)前體脂肪細胞的原代培養(yǎng)
        2.2 細胞的傳代培養(yǎng)
        2.3 細胞的誘導(dǎo)分化
        2.4 細胞分化PDK4、FGF10基因的時序表達
        2.5 重組質(zhì)粒的瞬時轉(zhuǎn)染
            2.5.1 無內(nèi)毒素質(zhì)粒的提取
            2.5.2 瞬時轉(zhuǎn)染
        2.6 PDK4、FGF10基因最佳干擾載體的篩選
        2.7 實時熒光定量PCR
    3 結(jié)果與分析
        3.1 從江香豬肌內(nèi)前體脂肪細胞形態(tài)觀察
        3.2 誘導(dǎo)分化及油紅O染色
        3.3 細胞分化PDK4、FGF10基因的時序表達
        3.4 PDK4、FGF10基因最佳干擾載體的篩選
            3.4.1 PDK4基因干擾載體的瞬時轉(zhuǎn)染
            3.4.2 PDK4基因干擾效率的檢測
            3.4.3 FGF10基因干擾載體的瞬時轉(zhuǎn)染
            3.4.4 FGF10基因干擾效率的檢測
        3.5 pEGFP-C1-PDK4、pEGFP-C1-FGF10的瞬時轉(zhuǎn)染
        3.6 PDK4、FGF10基因上調(diào)對脂代謝相關(guān)基因表達的影響
        3.7 PDK4、FGF10基因下調(diào)對脂代謝相關(guān)基因表達的影響
    4 討論
    5 小結(jié)
第六章 結(jié)論與展望
    1 結(jié)論
    2 展望
參考文獻
致謝
附錄



本文編號：3813809