發(fā)布時(shí)間：2023-04-24 21:25

　　豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus)屬于α冠狀病毒,可引起仔豬產(chǎn)生急性的、高度接觸性腸道傳染病。PEDV的感染會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞mRNA與miRNA表達(dá)水平動(dòng)態(tài)的變化,并與病毒形成復(fù)雜的作用網(wǎng)絡(luò)。全面的分析差異表達(dá)宿主因子對(duì)PEDV復(fù)制的調(diào)控,有助于完整地掌握病毒感染后細(xì)胞組分、生物學(xué)功能、信號(hào)通路的變化規(guī)律,了解PEDV的致病機(jī)制,篩選影響病毒入侵、調(diào)控病毒復(fù)制的宿主因子。Vero E6細(xì)胞是PEDV分離、傳代和進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的主要細(xì)胞。本研究通過對(duì)感染PEDV弱毒株CV777與強(qiáng)毒株LNct2的Vero E6細(xì)胞進(jìn)行RNA高通量測(cè)序,分析細(xì)胞內(nèi)mRNA及miRNA的差異表達(dá)情況。與對(duì)照組相比,CV777感染組篩選出33個(gè)差異表達(dá)基因,LNct2感染組篩選出1854個(gè)差異表達(dá)基因,兩組共有的差異基因?yàn)?6個(gè)。miRNA測(cè)序結(jié)果顯示CV777感染組共產(chǎn)生23個(gè)差異表達(dá)miRNA,LNct2感染組共產(chǎn)生70個(gè)差異表達(dá)miRNA,兩組共有的差異表達(dá)miRNA為10個(gè)。對(duì)差異表達(dá)的宿主因子進(jìn)行生物信息學(xué)分析,結(jié)果顯示差異表達(dá)因子主要富集在調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)...

【文章頁數(shù)】：104 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 豬流行性腹瀉病原學(xué)概述
        1.1.1 PEDV結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特性
        1.1.2 PEDV在中國(guó)的流行情況
        1.1.3 PEDV的防控與治療
    1.2 PEDV入侵宿主細(xì)胞機(jī)制進(jìn)展
    1.3 冠狀病毒mRNA翻譯機(jī)制
        1.3.1 冠狀病毒mRNA翻譯具有Cap結(jié)構(gòu)依賴性
        1.3.2 冠狀病毒IRES介導(dǎo)的翻譯
        1.3.3 宿主與病毒蛋白調(diào)節(jié)冠狀病毒mRNA的翻譯
    1.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)概述
    1.5 miRNA研究進(jìn)展
        1.5.1 miRNA生物學(xué)概述
        1.5.2 miRNA的生物合成
        1.5.3 miRNA介導(dǎo)的mRNA降解機(jī)制
        1.5.4 miRNA與病毒感染
    1.6 本研究的目的意義
第二章 PEDV感染Vero E6 細(xì)胞mRNA/miRNA表達(dá)譜分析
    2.1 材料和方法
        2.1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.2 毒株、細(xì)胞和抗體
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 構(gòu)建PEDV感染mRNA/miRNA表達(dá)譜測(cè)序細(xì)胞的篩選
            2.2.1.1 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)
            2.2.1.2 半數(shù)感染量的測(cè)定(TCID₅₀)
            2.2.1.3 熒光定量PCR檢測(cè)病毒載量
        2.2.2 PEDV感染細(xì)胞mRNA/miRNA高通量測(cè)序
        2.2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析
            2.2.3.1 測(cè)序質(zhì)量分析與表達(dá)差異分析
            2.2.3.2 差異表達(dá)基因功能富集分析
        2.2.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證
            2.2.4.1 RT-qPCR驗(yàn)證差異表達(dá)mRNA變化
            2.2.4.2 RT-qPCR驗(yàn)證干擾素刺激基因差異表達(dá)
            2.2.4.3 Western blot驗(yàn)證MAPK通路變化
        2.2.5 miRNA表達(dá)差異分析
        2.2.6 miRNA高通量測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證
            2.2.6.1 miRNA提取與反轉(zhuǎn)錄
            2.2.6.2 miRNA RT-qPCR驗(yàn)證
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 PEDV感染靶細(xì)胞的篩選
            2.3.1.1 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)
            2.3.1.2 TCID₅₀的測(cè)定
            2.3.1.3 熒光定量PCR檢測(cè)病毒載量
        2.3.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析
            2.3.2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果整理與質(zhì)量分析
            2.3.2.2 差異表達(dá)mRNA分析
            2.3.2.3 差異表達(dá)基因功能GO富集分析
            2.3.2.4 KEGG細(xì)胞通路富集分析
        2.3.3 PEDV感染差異表達(dá)mRNA驗(yàn)證
            2.3.3.1 RT-qPCR驗(yàn)證主要差異表達(dá)mRNA
            2.3.3.2 RT-qPCR驗(yàn)證差異表達(dá)ISGs
            2.3.3.3 PEDV感染激活MAPK信號(hào)通路
        2.3.4 PEDV感染Vero E6 細(xì)胞miRNA表達(dá)規(guī)律
            2.3.4.1 原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及過濾
            2.3.4.2 差異表達(dá)miRNA分析
            2.3.4.3 差異表達(dá)miRNA候選靶基因GO富集分析
            2.3.4.4 差異表達(dá)miRNA候選靶基因KEGG富集分析
        2.3.5 加poly(A)尾法RT-qPCR驗(yàn)證miRNA測(cè)序結(jié)果
    2.4 討論
        2.4.1 PEDV感染后差異mRNA表達(dá)規(guī)律分析
        2.4.2 miRNA與 mRNA表達(dá)譜聯(lián)合分析
第三章 Abl2 影響PEDV復(fù)制機(jī)制研究
    3.1 材料和方法
        3.1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒和病毒
        3.1.2 抗體、試劑盒、抑制劑
        3.1.3 敲低Abl2對(duì)PEDV復(fù)制的影響
            3.1.3.1 RNAi干擾實(shí)驗(yàn)
            3.1.3.2 抑制劑實(shí)驗(yàn)
        3.1.4 抑制劑加入時(shí)間對(duì)PEDV復(fù)制的影響
        3.1.5 IFA檢測(cè)PEDV介導(dǎo)的細(xì)胞融合
        3.1.6 Abl2對(duì)其他豬腸道冠狀病毒感染的影響
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 siRNA下調(diào)Abl2 表達(dá)抑制PEDV的增殖
        3.2.2 Abl2 抑制劑可顯著抑制PEDV復(fù)制
        3.2.3 Abl2 不影響PEDV吸附過程
        3.2.4 Abl2 影響PEDV復(fù)制早期階段
        3.2.5 Imatinb在病毒入侵階段抑制PEDV復(fù)制
        3.2.6 Abl2 抑制劑抑制PEDV誘導(dǎo)的合胞體的形成
        3.2.7 Abl2對(duì)豬腸道冠狀病毒復(fù)制的影響
    3.3 討論
第四章 影響PEDV復(fù)制miRNA的篩選及其靶基因的驗(yàn)證
    4.1 材料和方法
        4.1.1 細(xì)胞、毒株和載體
        4.1.2 主要試劑與儀器
        4.1.3 影響PEDV復(fù)制差異表達(dá)miRNA篩選
        4.1.4 miR-486-5p靶基因的預(yù)測(cè)
        4.1.5 miR-486-5p靶基因的驗(yàn)證
            4.1.5.1 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)miR-486-5p與靶基因3’UTR結(jié)合
            4.1.5.2 RNAi干擾靶基因?qū)EDV復(fù)制的影響
        4.1.6 RT-qPCR檢測(cè)PEDV感染后SRSF3 mRNA表達(dá)水平變化
        4.1.7 敲低SRSF3對(duì)PEDV復(fù)制的影響
        4.1.8 過表達(dá)SRSF3對(duì)PEDV復(fù)制的影響
            4.1.8.1 SRSF3真核表達(dá)載體的構(gòu)建
            4.1.8.2 SRSF3 轉(zhuǎn)染Vero E6 細(xì)胞
            4.1.8.3 PEDV感染過表達(dá)SRSF3 Vero E6 細(xì)胞
        4.1.9 激光共聚焦實(shí)驗(yàn)
        4.1.10 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 影響PEDV復(fù)制的差異表達(dá)miRNA初步篩選
        4.2.2 miR-486-5p抑制PEDV復(fù)制
        4.2.3 miR-486-5p與靶基因互作網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建
        4.2.4 miR-486-5p靶基因的驗(yàn)證
            4.2.4.1 RT-qPCR驗(yàn)證miR-486-5p的靶基因
            4.2.4.2 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miR-486-5p的靶基因
            4.2.4.3 敲低miR-486-5p候選靶基因?qū)EDV復(fù)制的影響
        4.2.5 SRSF3在PEDV感染過程中顯著上調(diào)
        4.2.6 敲低SRSF3抑制PEDV的復(fù)制
        4.2.7 過表達(dá)SRSF3促進(jìn)PEDV的復(fù)制
        4.2.8 SRSF3與PEDV N蛋白不發(fā)生相互作用
    4.3 討論
第五章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3800042