豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是近年來新發(fā)現(xiàn)的引起豬繁殖障礙等多種疫病的一種重要病原。PCV2為無囊膜的單股環(huán)狀DNA病毒，基因組全長約為1767bp，病毒的衣殼蛋白只含有一種衣殼蛋白ORF2，60分子的ORF2蛋白可自主組裝產(chǎn)生二十面體對稱的病毒衣殼結(jié)構(gòu)。已有報道可利用昆蟲細(xì)胞與大腸桿菌表達(dá)組裝產(chǎn)生結(jié)構(gòu)相似的PCV2空衣殼樣粒子。本研究旨在以PCV2ORF2衣殼蛋白為骨架，嵌合表達(dá)口蹄疫病毒(FMDV)的主要中和表位，測定嵌合表位蛋白的免疫原性，為以PCV2衣殼蛋白為骨架嵌合展示異源表位、研究表位展示疫苗奠定基礎(chǔ)。 PCV2ORF2蛋白N-端前41個氨基酸為核定位序列(NLS)，為衣殼組裝的非必需區(qū)；PCV2ORF2衣殼蛋白單體由8個β-折疊片層與之間的loop環(huán)結(jié)構(gòu)組成，連接BC、DE、FG與HI的loop環(huán)長度為4⁹aa，連接CD、EF與GH環(huán)長度為21³6aa，長loop環(huán)對穩(wěn)定衣殼結(jié)構(gòu)有重要作用。 根據(jù)上述研究背景，本研究構(gòu)建了5種改造的PCV2衣殼蛋白，分別為N端NLS序列置換為FMDV中和性抗原表位(O/Mya/98FMDV VP1...

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【學(xué)位級別】：碩士

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摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 豬圓環(huán)病毒
        1.1.1 PCV2 自然感染的致病機制
        1.1.2 圓環(huán)病毒基因組特征及研究進展
            1.1.2.1 ORF1 基因的研究
            1.1.2.2 ORF2 基因的研究
            1.1.2.3 ORF3 基因的研究
        1.1.3 圓環(huán)病毒衣殼結(jié)構(gòu)研究進展
            1.1.3.1 PCV2 衣殼蛋白的裝配方式
            1.1.3.2 PCV2 衣殼結(jié)構(gòu)解析的重要性
            1.1.3.3 PCV2 衣殼蛋白的基本構(gòu)造特征
            1.1.3.4 PCV2 衣殼蛋白表面的抗原位點
            1.1.3.5 PCV2 基于結(jié)構(gòu)的侵染機制
    1.2 口蹄疫病毒
        1.2.1 FMDV 的持續(xù)性感染
        1.2.2 FMDV P1 區(qū)與衣殼蛋白
        1.2.3 FMDV 抗原表位
        1.2.4 G-H 環(huán)合成肽仿制品
            1.2.4.1 載體蛋白和病毒嵌合體
            1.2.4.2 環(huán)合肽
            1.2.4.3 逆向-倒轉(zhuǎn)肽類似物
第二章 N 端嵌合口蹄疫病毒中和表位的豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白表達(dá)與免疫原性研究
    2.1 重組蛋白 PCV2 ORF2-VP1 和原衣殼蛋白 PCV2 ORF2 結(jié)構(gòu)預(yù)測分析
        2.1.1 方法
        2.1.2 結(jié)果
        2.1.3 討論
    2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒 PET28A-ORF2-VP1(N)，PET28A-ORF2 的構(gòu)建
        2.2.1 實驗材料
            2.2.1.1 病料
            2.2.1.2 表達(dá)載體和感受態(tài)細(xì)胞
            2.2.1.3 酶和試劑
            2.2.1.4 儀器
            2.2.1.5 實驗所需溶液
                2.2.1.5.1 培養(yǎng)基
                2.2.1.5.2 瓊脂糖凝膠核酸電泳制備
        2.2.2 實驗方法
            2.2.2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒 pET28a-ORF2 的構(gòu)建
                2.2.2.1.1 病毒 DNA 的提取
                2.2.2.1.2 PCV2 ORF2 基因 PCR
                2.2.2.1.3 PCV2 ORF2 DNA 純化
                2.2.2.1.4 pGEM T-ORF2 的構(gòu)建
                    2.2.2.1.4.1 回收片段 PCV2 ORF2 與克隆載體 pGEM-T 載體的連接
                    2.2.2.1.4.2 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
                    2.2.2.1.4.3 重組質(zhì)粒 pGEM T-ORF2 質(zhì)粒的提取
                    2.2.2.1.4.4 重組質(zhì)粒 pGEM T-ORF2 質(zhì)粒的酶切鑒定
                2.2.2.1.5 pET28a-ORF2 的構(gòu)建
            2.2.2.2 N 端嵌合 FMDV 表位重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
                2.2.2.2.1 N 端嵌合 FMDV 表位的 PCV2 ORF2 基因的優(yōu)化合成
                2.2.2.2.2 pET28a-ORF2-VP1 的構(gòu)建
        2.2.3 實驗結(jié)果
            2.2.3.1 基因擴增
            2.2.3.2 pET28a-ORF2 的構(gòu)建
            2.2.3.3 pET28a-ORF2-VP1(N)的構(gòu)建
        2.2.4 討論
    2.3 重組蛋白 PCV2 ORF2-VP1(N)與衣殼蛋白 PCV2 ORF2 的原核表達(dá)、純化與復(fù)性
        2.3.1 實驗材料
            2.3.1.1 感受態(tài)細(xì)胞
            2.3.1.2 酶和主要試劑
            2.3.1.3 儀器
            2.3.1.4 實驗所需溶液
                2.3.1.4.1 培養(yǎng)基
                2.3.1.4.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）所用溶液
        2.3.2 實驗方法
            2.3.2.1 重組質(zhì)粒 pET28a-ORF2-VP1(N)，pET28a-ORF2 的誘導(dǎo)表達(dá)
            2.3.2.2 表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析
            2.3.2.3 包涵體裂解
            2.3.2.4 蛋白質(zhì)純化
            2.3.2.5 蛋白質(zhì)復(fù)性
            2.3.2.6 復(fù)性蛋白活性檢測
        2.3.3 實驗結(jié)果
            2.3.3.1 重組蛋白 PCV2 ORF2-VP1(N)與衣殼蛋白 PCV2 ORF2 的表達(dá)形式鑒定
            2.3.3.2 重組蛋白 PCV2 ORF2-VP1(N)與衣殼蛋白 PCV2 ORF2 純化結(jié)果分析
            2.3.3.3 重組蛋白 PCV2 ORF2-VP1(N)與衣殼蛋白 PCV2 ORF2 復(fù)性后免疫反應(yīng)性檢測
        2.3.4 討論
    2.4 重組蛋白 ORF2-VP1(N)與衣殼蛋白 ORF2 的免疫原性測定
        2.4.1 實驗材料
            2.4.1.1 實驗動物
            2.4.1.2 試劑
            2.4.1.3 儀器
        2.4.2 實驗方法
            2.4.2.1 抗原制備
            2.4.2.2 實驗分組
            2.4.2.3 小鼠脾淋巴細(xì)胞的制備
            2.4.2.4 細(xì)胞因子測定
            2.4.2.5 免疫小鼠血清 FMDV 抗體檢測
                2.4.2.5.1 FMDV 特異性抗體水平檢測
                2.4.2.5.2 FMDV 中和抗體滴度測定
            2.4.2.6 免疫小鼠血清 PCV2 抗體檢測
        2.4.3 實驗結(jié)果
            2.4.3.1 重組蛋白免疫小鼠細(xì)胞因子水平測定
            2.4.3.2 重組蛋白免疫小鼠 FMDV 抗體水平檢測
            2.4.3.3 重組蛋白免疫小鼠 PCV2 抗體水平檢測
        2.4.4 討論
第三章 LOOP 環(huán)替換口蹄疫病毒中和表位的豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白表達(dá)與免疫原性研究
    3.1 重組蛋白 ORF2-VP1 (CD), ORF2-VP1 (EF), ORF2-VP1 (GH), ORF2-VP1 (ALL)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析
        3.1.1 方法
        3.1.2 結(jié)果
        3.1.3 討論
    3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒 PET28A-ORF2-VP1 (CD), PET28A-ORF2-VP1 (EF), PET28A-ORF2-V P1 (GH), PET28A-ORF2-VP1 (ALL)的構(gòu)建
        3.2.1 實驗材料
        3.2.2 實驗方法
            3.2.2.1 Loop 環(huán)替換 FMDV 表位基因的優(yōu)化合成
            3.2.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒 pET28a-ORF2-VP1 (CD), pET28a-ORF2-VP1 (EF), pET28a -ORF2-VP1 (GH), pET28a-ORF2-VP1 (All)的構(gòu)建
        3.2.3 實驗結(jié)果
        3.2.4 討論
    3.3 重組蛋白 ORF2-VP1 (CD), ORF2-VP1 (EF), ORF2-VP1 (GH), ORF2-VP1 (ALL)的 原核表達(dá)、純化與復(fù)性
        3.3.1 實驗材料
        3.3.2 實驗方法
        3.3.3 實驗結(jié)果
            3.3.3.1 重組蛋白 ORF2-VP1(CD), ORF2-VP1(EF), ORF2-VP1(GH), ORF2-VP1(All)的表達(dá)形式鑒定
            3.3.3.2 重組蛋白 ORF2-VP1(CD), ORF2-VP1(EF), ORF2-VP1(GH), ORF2-VP1(All)純化結(jié)果分析
            3.3.3.3 重組蛋白 ORF2-VP1(CD), ORF2-VP1(EF), ORF2-VP1(GH), ORF2-VP1(All)復(fù)性后免疫反應(yīng)性檢測
        3.3.4 討論
    3.4 重組蛋白 ORF2-VP1(CD), ORF2-VP1(EF), ORF2-VP1(GH), ORF2-VP1(ALL)的免疫原性測定
        3.4.1 實驗材料
        3.4.2 實驗方法
            3.4.2.1 抗原制備
            3.4.2.2 實驗分組
            3.4.2.3 小鼠脾淋巴細(xì)胞的制備
            3.4.2.4 細(xì)胞因子測定
            3.4.2.5 免疫小鼠血清 FMDV 中和抗體滴度測定
            3.4.2.6 免疫小鼠血清 PCV2 抗體檢測
        3.4.3 實驗結(jié)果
            3.4.3.1 重組蛋白免疫小鼠細(xì)胞因子水平測定
            3.4.3.2 重組蛋白免疫小鼠 FMDV LPB-ELISA 抗體水平檢測
            3.4.3.3 重組蛋白免疫小鼠 PCV2 抗體水平檢測
        3.4.4 討論
第四章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡歷



本文編號：3797579