本研究通過(guò)對(duì)TGEV已知表位的分析,選擇具有針對(duì)性免疫保護(hù)的T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位,以linker將各表連接起來(lái),構(gòu)建TGEV多表位抗原的重組菌(pBMB-SN/WB600, pMA5-pSN/WB600)對(duì)其進(jìn)行免疫評(píng)價(jià)。為更好的防治TGE提供一種理論依據(jù)。主要的研究?jī)?nèi)容如下：1.多表位抗原基因選擇和設(shè)計(jì)合成通過(guò)對(duì)TGEV已知表位分析,選擇了TGEVS蛋白中的A、D抗原表位,N蛋白中的N321抗原表位,根據(jù)枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)密碼子的偏愛(ài)性,對(duì)選擇的各表位基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化,各表位之間通過(guò)Linker((GGGGS)3)相連,人工合成多表位抗原基因序列SN(D-N321-A)。2.兩種不同表達(dá)方式重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建為了獲得免疫原性較強(qiáng)的重組菌株,對(duì)合成的多表位基因SN進(jìn)行修飾,構(gòu)建了多拷貝展示表達(dá)重組菌和分泌表達(dá)重組菌。多拷貝展示表達(dá)重組菌的構(gòu)建：在pET-28a載體上,利用同尾酶(SaiⅠ和XhoⅠ)將SN序列進(jìn)行雙拷貝和三拷貝,然后克隆到pBMB982-304后,電轉(zhuǎn)到枯草芽孢桿菌WB600中,構(gòu)建了多拷貝展示表達(dá)重組枯草芽孢桿菌pBMB-SN/WB600、 pBMB-2S...

【文章頁(yè)數(shù)】：63 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略表(Abbreviation)
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 豬傳染性胃腸炎流行性病學(xué)
    1.2 豬傳染性胃腸炎病毒疫苗研究進(jìn)展
        1.2.1 常規(guī)疫苗
        1.2.2 基因工程疫苗
        1.2.3 TGEV基因工程疫苗存在的問(wèn)題與展望
    1.3 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展
    1.4 兩種不同表達(dá)方式的應(yīng)用
        1.4.1 細(xì)菌細(xì)胞表面展示與應(yīng)用
        1.4.2 細(xì)菌分泌表達(dá)的研究
    1.5 免疫佐劑CpG-ODN和YT研究進(jìn)展
        1.5.1 佐劑CpG-ODN
        1.5.2 YT佐劑
第二章 目的與意義
第三章 材料和方法
    3.1 材料
        3.1.1 質(zhì)粒、菌株
        3.1.2 主要試劑與樣品
        3.1.3 主要的試驗(yàn)器材
        3.1.4 主要的培養(yǎng)基及相關(guān)試劑的配制
        3.1.5 引物
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 TGEV多表位抗原基因的設(shè)計(jì)和合成
        3.2.2 PCR擴(kuò)增靶基因
        3.2.3 PCR和酶切產(chǎn)物的電泳檢測(cè)
        3.2.4 限制性內(nèi)切酶反應(yīng)
        3.2.5 PCR產(chǎn)物以及酶切產(chǎn)物回收與純化
        3.2.6 DNA片段與載體的連接
        3.2.7 質(zhì)粒的小量提取
        3.2.8 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備
        3.2.9 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化
        3.2.10 SDS-PAGE鑒定
    3.3 重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建
        3.3.1 電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基的配制
        3.3.2 枯草芽孢桿菌感受態(tài)的制備
        3.3.3 枯草芽孢桿菌的電轉(zhuǎn)化
        3.3.4 重組菌株表達(dá)載體的構(gòu)建以及重組菌的鑒定
    3.4 重組菌株的生物學(xué)特性研究
        3.4.1 重組菌株的蛋白表達(dá)
        3.4.2 重組菌株生長(zhǎng)特性的鑒定
        3.4.3 重組菌的生化特性鑒定
        3.4.4 重組菌株遺傳穩(wěn)定性的鑒定
        3.4.5 電鏡檢驗(yàn)
    3.5 ELISA方法的建立
        3.5.1 陽(yáng)性血清和陰性血清的制備
        3.5.2 ELISA具體步驟
    3.6 重組菌株的小鼠免疫試驗(yàn)
        3.6.1 小鼠口服重組菌株試驗(yàn)
        3.6.2 免疫小鼠抗體的采集
第四章 結(jié)果與分析
    4.1 串聯(lián)多拷貝載體的的構(gòu)建與鑒定
        4.1.1 串聯(lián)多拷貝載體的構(gòu)建
        4.1.2 重組質(zhì)粒的PCR和酶切鑒定
    4.2 菌體表面展示表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.2.1 重組菌株的表達(dá)
        4.2.2 重組菌株的間接免疫熒光試驗(yàn)
    4.3 分泌表達(dá)重組菌的構(gòu)建與表達(dá)
        4.3.1 分泌表達(dá)重組菌構(gòu)建
        4.3.2 重組菌的表達(dá)
    4.4 重組菌株的遺傳穩(wěn)定性
    4.5 重組菌株的生長(zhǎng)特性鑒定
    4.6 重組菌株的生化特性
    4.7 重組菌株和親本菌形態(tài)學(xué)觀察
    4.8 免疫小鼠的免疫原性測(cè)定
        4.8.1 分泌表達(dá)重組菌株的蛋白分析
        4.8.2 小鼠口服重組菌后血清中特異性抗體的檢測(cè)
        4.8.3 小鼠口服重組菌后腸黏膜中特異性抗體的檢測(cè)
        4.8.4 小鼠糞便中特異性抗體檢測(cè)
第五章 討論
    5.1 TGEV基因工程口服疫苗的必要性
    5.2 多表位抗原基因SN的設(shè)計(jì)與合成
    5.3 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)
    5.4 重組菌對(duì)小鼠的免疫實(shí)驗(yàn)
    5.5 佐劑CPG-OND和YT對(duì)口服動(dòng)物免疫的影響
第六章 結(jié)語(yǔ)
    6.1 結(jié)論
    6.2 創(chuàng)新與存在的問(wèn)題
        6.2.1 創(chuàng)新點(diǎn)
        6.2.2 存在的問(wèn)題
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3797734