新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的危害養(yǎng)禽業(yè)的一種主要傳染病。NDV能夠感染大多數(shù)鳥類,速發(fā)型NDV為A類病原,一旦發(fā)生需要向世界動物衛(wèi)生組織(OIE)報告。ND的爆發(fā)導(dǎo)致了嚴(yán)格的封港禁運。NDV是副粘病毒亞科的一名成員,RNA基因組為單股負(fù)鏈。目前主要采用基于NDV的中和試驗來檢測雞血清中抗NDV的中和抗體,但這種傳統(tǒng)的中和抗體檢測方法耗時較長且主觀,因此本研究希望通過構(gòu)建NDV的假型化病毒,建立依賴于NDV假型病毒的新型中和試驗方法來檢測雞血清中抗NDV的中和抗體。本研究主要構(gòu)建了 NDV囊膜蛋白血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)和融合蛋白(F)包裹HIV-Luciferase(HIV-Luc)骨架構(gòu)建感染性假型病毒,建立了采用NDV假型化HIV-Luc假型病毒來評價NDV中和抗體效價的新型中和試驗方法,并且可替代傳統(tǒng)中和試驗進(jìn)行血清抗NDV中和抗體評價。此外為檢測NDV的HN蛋白,本研究還制備了抗NDV HN的單鏈抗體(scFv)并驗證了其生物學(xué)活性。1新城疫病毒假型病毒體系的構(gòu)建及生物活性分析本實驗通過以NDV囊膜蛋白HN和F包裹HIV-Luc骨架構(gòu)建感染性假型病毒,并深入研...

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
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摘要
ABSTRACT
第一篇 文獻(xiàn)綜述
    第一章 新城疫病毒研究綜述
        1 新城疫概況
        2 NDV形態(tài)及其基因組結(jié)構(gòu)
        3 NDV各結(jié)構(gòu)蛋白特征
            3.1 融合蛋白(F)
            3.2 血凝素——神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)
            3.3 基質(zhì)蛋白(M)
            3.4 核衣殼蛋白(NP)
            3.5 磷蛋白(P)
            3.6 大分子蛋白(L)
        4 NDV的生物學(xué)特征
        5 抗NDV抗體檢測
            5.1 血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗
            5.2 中和試驗(neutralization tests)
            5.3 瓊脂凝膠擴散試驗(AGID)
            5.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)
    第二章 假型病毒的應(yīng)用研究進(jìn)展
        1 假型病毒生物學(xué)特征
        2 假型病毒的包裝制備
        3 假型病毒的實驗室及臨床應(yīng)用
            3.1 假型病毒宿主細(xì)胞嗜性及靶向應(yīng)用
            3.2 假型病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)
            3.3 假型病毒用于中和抗體效價評價
            3.4 假型病毒的基因治療
    第三章 單鏈抗體應(yīng)用研究進(jìn)展
        1 單鏈抗體結(jié)構(gòu)
        2 scFv的構(gòu)建
        3 scFv的表達(dá)
            3.1 scFv在細(xì)菌中的表達(dá)
            3.2 scFv在酵母細(xì)胞中的表達(dá)
            3.3 scFv在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)
        4 scFv的應(yīng)用
            4.1 scFv在檢測中的應(yīng)用
            4.2 scFv的中和作用
            4.3 scFv的靶向作用
            4.4 scFv的基因治療作用
            4.5 scFv在診斷中的應(yīng)用
第二篇 試驗研究
    第一章 新城疫病毒假型病毒體系的構(gòu)建
        1 材料
            1.1 細(xì)胞、病毒
            1.2 主要試劑及儀器
        2 方法
            2.1 病毒RNA提取和cDNA合成
            2.2 PCR引物的設(shè)計
            2.3 PCR擴增NDV的HN和F基因
            2.4 PCR擴增VCT/HN、VCT-HN、F/VCT和FACT基因
            2.5 重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.6 重組膜蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒鑒定
            2.7 重組膜蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)鑒定
            2.8 NDV假型病毒的包裝及收獲
            2.9 NDV假型病毒中HN和F蛋白的鑒定
            2.10 NDV假型病毒感染293T細(xì)胞與Luc熒光活性檢測
            2.11 HIV-1 P24抗原定量假型病毒
            2.12 NDV病毒和NDV假型病毒TCID₅₀測定
            2.13 建立NDV假型病毒中和試驗
            2.14 NDV假型病毒中和試驗與傳統(tǒng)中和試驗的比較
        3 結(jié)果與分析
            3.1 HN和F基因的克隆
            3.2 VCT/HN、VCT-HN、F/VCT和FACT基因片段的的擴增
            3.3 重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定
            3.4 重組真核表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)鑒定
            3.5 NDV假型病毒粒子中HN和F蛋白的ELISA檢測
            3.6 NDV假型病毒感染293T細(xì)胞后的Luciferase活性檢測
            3.7 影響NDV假型化HIV-Luc假型病毒感染效率的因素
            3.8 NDV假型病毒中和試驗的建立
            3.9 NDV假型化HIV-Luc假型病毒中和試驗的驗證
        4 討論
    第二章 抗新城疫病毒HN蛋白單鏈抗體的原核表達(dá)及其功能鑒定
        1 材料和方法
            1.1 主要實驗材料
            1.2 雜交瘤細(xì)胞總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄
            1.3 抗體全長基因的擴增及其可變區(qū)分析
            1.4 VL和VH的PCR擴增
            1.5 HN-scFv原核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
            1.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定
            1.7 包涵體復(fù)性和純化
            1.8 復(fù)性蛋白活性檢測
        2 結(jié)果
            2.1 全長抗HN McAb輕鏈和重鏈基因的克隆
            2.2 抗體可變區(qū)VL和VH分析
            2.3 HN-scFv原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定
            2.4 HN-scFv的誘導(dǎo)表達(dá)及復(fù)性、純化
            2.5 HN-scFv的功能檢測
        3 討論
第三篇 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號：3797296