本試驗旨在構(gòu)建不同纖維素酶的融合表達系統(tǒng)及探討融合纖維素酶的酶學性質(zhì)。利用PCR技術(shù)從實驗室前期分離的枯草芽孢桿菌中分別擴增2個纖維素酶基因Cel42和Cel22,設(shè)計一段柔性接頭(GSGGGS),通過酶切連接將2個纖維素酶基因構(gòu)建在一個開放閱讀框(ORF)內(nèi),插入到pET32a(+)中構(gòu)建重組表達載體pET32a(+)-Cel42-Cel22,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進行誘導(dǎo)表達,并對其酶學性質(zhì)進行研究。結(jié)果表明:本試驗成功克隆了2個纖維素酶基因Cel42和Cel22,并構(gòu)建了重組表達系統(tǒng)BL21(DE3)/pET32a(+)-Cel42-Cel22,十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)估計其分子質(zhì)量約為101 ku,粗酶液中葡聚糖內(nèi)切酶活性為57.62 U/mL,葡聚糖外切酶活性為32.57 U/mL。試驗所得融合纖維素酶Cel42-Cel22的最適反應(yīng)溫度為50℃,最適反應(yīng)pH為6.0,溫度在30⁷0℃范圍內(nèi)時可維持70%以上的纖維素酶活性,pH在4.0⁹.0范圍內(nèi)時可保持75%以上的纖維素酶活性,除Mn^...

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株和質(zhì)粒
        1.1.2 酶和主要試劑
    1.2 方法
        1.2.1 目的基因的克隆
        1.2.2 融合表達載體的構(gòu)建
        1.2.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS#PAGE) 檢測
        1.2.4 融合纖維素酶Cel42#Cel22的酶活性測定
            1.2.4. 1 葡聚糖內(nèi)切酶活性測定
            1.2.4. 2 葡聚糖外切酶活性測定
        1.2.5 融合纖維素酶Cel42#Cel22的最適反應(yīng)溫度與熱穩(wěn)定性
        1.2.6 融合纖維素酶Cel42#Cel22的最適反應(yīng)pH及酸堿穩(wěn)定性
        1.2.7 金屬離子對融合纖維素酶Cel42#Cel22活性的影響
        1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
2 結(jié)果
    2.1 纖維素酶基因Cel42和Cel22的克隆結(jié)果
    2.2 重組質(zhì)粒pMD18#Cel42#Cel22的PCR擴增及酶切鑒定結(jié)果
    2.3 重組質(zhì)粒pET32a (+) #Cel42#Cel22的PCR擴增及酶切鑒定結(jié)果
    2.4 融合蛋白的表達
    2.5 融合纖維素酶Cel42#Cel22酶活性的測定結(jié)果
    2.6 溫度對融合纖維素酶Cel42#Cel22活性及穩(wěn)定性的影響
    2.7 pH對融合纖維素酶Cel042#Cel22活性及穩(wěn)定性的影響
    2.8 金屬離子對融合纖維素酶Cel042#Cel22活性的影響
3 討論
4 結(jié)論



本文編號：3795455