口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的高度接觸性傳染病,主要侵害偶蹄動物產生急性高熱等癥狀。該病感染能力強,傳播途徑多,在多個國家和地區(qū)發(fā)生過大流行,嚴重阻礙了畜牧業(yè)發(fā)展。口蹄疫病毒有7個血清型,分別為O、A、C、Asia 1、SAT 1-3型,每個血清型又包含多個亞型,各型之間不存在交叉反應。我國的主要流行血清型為A型、O型和Asia 1型。2009至2013年間,在我國上海、湖北、武漢、新疆阿克蘇地區(qū)以及周邊國家多次爆發(fā)A型口蹄疫疫情,給當?shù)亟洕鷰砹司薮蟮膿p失。為建立一種有效檢測A型FMD的方法,首先需獲得具有活性的A型FMDV VP1蛋白。經過PCR擴增得到A型FMDVvp1基因片段,與原核表達載體pET-28a連接,構建重組質粒pET-A-vp1。經IPTG誘導表達含重組質粒pET-A-vp1的E.coli BL21(DE3)菌后,SDS-PAGE及Western-Blot分析表明,A-VP1重組蛋白分子質量約為29 ku,能夠被A型口蹄疫陽性血清特異性識別,蛋白...

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
第一部分 文獻綜述
    1 口蹄疫概述
        1.1 口蹄疫簡介
        1.2 FMD的流行情況
    2 FMDV的分子生物學特性
        2.1 FMDV病原學特征
        2.2 FMDV基因組特征
        2.3 FMDV結構蛋白和功能
        2.4 FMDV VP1的意義
        2.5 FMDV非結構蛋白及其功能
        2.6 FMDV的感染機制
    3 FMD診斷技術研究進展
        3.1 FMDV分離鑒定
        3.2 血清學檢測技術
        3.3 分子生物學檢測技術
        3.4 ELISA在FMD中的應用
第二部分 A型口蹄疫病毒結構蛋白VP1原核表達
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 菌株、血清
        2.2 主要試劑
        2.3 主要儀器和設備
        2.4 主要試劑的配制
        2.5 重組表達載體的構建與建立
        2.6 誘導表達
        2.7 可溶性分析
        2.8 重組A-VP1蛋白的純化
        2.9 ELISA檢測純化A-VP1蛋白的活性
    3 結果與分析
        3.1 A-vp1基因的PCR擴增結果
        3.2 重組質粒的構建與鑒定結果
        3.3 表達產物SDS-PAGE鑒定
        3.4 表達產物Western-Blot鑒定
        3.5 重組蛋白的誘導表達優(yōu)化結果
        3.6 重組蛋白的可溶性分析結果
        3.7 重組蛋白的純化及復性結果
        3.8 ELISA檢測復性蛋白的活性
    4 討論
第三部分 A型口蹄疫病毒VP1蛋白間接ELISA檢測試劑盒的開發(fā)
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 試劑及血清
        2.2 A-VP1蛋白臨床檢測應用初步鑒定
        2.3 間接ELISA試劑盒的研制及初步應用
    3 結果
        3.1 A-VP1蛋白鑒定結果
        3.2 抗原最佳包被量的確定
        3.3 血清和酶標抗體的工作濃度
        3.4 最佳抗原包被液的確定
        3.5 最佳封閉時間的確定
        3.6 最佳血清作用時間的確定
        3.7 最佳酶標二抗作用時間的確定
        3.8 底物作用時間確定
        3.9 判定標準確定
        3.10 特異性和敏感性
        3.11 重復性試驗
        3.12 對比試驗
        3.13 保質期試驗
        3.14 試劑盒的組成及說明書
    4 討論
第四部分 全文總結
參考文獻
Abstract



本文編號：3767287