發(fā)布時間：2023-03-10 19:41

　　鴨病毒性腸炎(duck viral enteritis，DVE)，又名鴨瘟(duck plague，DP)，是鴨、鵝及多種雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病，曾相繼在多個國家和地區(qū)流行，給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本病病原為鴨腸炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)，亦稱鴨皰疹病毒1型(Anatid herpesvirus1)，在2011年第九次病毒分類報告(ICTV)中，將其劃分為皰疹病毒科甲型皰疹病毒亞科馬立克病毒屬。 根據(jù)本實驗室克隆DEV C-KCE株US區(qū)序列和TK序列設(shè)計引物，擴(kuò)增同源臂基因，將左右同源臂基因克隆至pEASY-blunt simple和pMD18-T simple載體，構(gòu)建pEASY-S3和pMD18T-TK載體。將表達(dá)盒插入pEASY-S3、pMD18-T-TK兩同源臂構(gòu)建缺失病毒轉(zhuǎn)移載體pEASY-S3-gpt-EGFP、pMD18-T-TK-gpt。將重組載體與DEV感染細(xì)胞的總DNA共轉(zhuǎn)染次代鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)，利用霉酚酸(MPA)加壓，8代篩選、富集和純化，得到重組病毒，經(jīng)PCR、IIF鑒定正確，命名為DEV-ΔS3...

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 鴨病毒性腸炎概述
        1.1.1 臨床癥狀與病理剖檢
        1.1.2 診斷
        1.1.3 鴨病毒性腸炎的防治
    1.2 鴨腸炎病毒研究進(jìn)展
        1.2.1 DEV 的生物學(xué)特性
        1.2.2 DEV 的分子生物學(xué)特性
        1.2.3 鴨腸炎病毒 SORF3 基因和 TK 基因的研究進(jìn)展
    1.3 皰疹病毒載體研究進(jìn)展
        1.3.1 基因缺失疫苗
        1.3.2 重組活載體疫苗
    1.4 本研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 試驗動物
        2.1.2 質(zhì)粒、載體、菌株、和毒株
        2.1.3 主要試劑及抗體
        2.1.4 主要儀器
    2.2 重組病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
        2.2.1 重組病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建策略
        2.2.2 引物設(shè)計與合成
        2.2.3 病毒核酸的提取
        2.2.4 同源臂的擴(kuò)增
        2.2.5 PCR 產(chǎn)物的克隆與轉(zhuǎn)化
        2.2.6 重組陽性質(zhì)粒的篩選與鑒定
        2.2.7 左、右同源臂連接
        2.2.8 pMD18-T-gpt-EGFP 和 pMD18-T-gpt 表達(dá)盒的構(gòu)建
        2.2.9 缺失病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
    2.3 重組病毒的構(gòu)建與篩選
        2.3.1 重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的大量制備
        2.3.2 DEV 全基因組與重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染
        2.3.3 重組病毒的篩選及純化
    2.4 重組病毒的鑒定
        2.4.1 引物設(shè)計與合成
        2.4.2 重組病毒的 PCR 鑒定
        2.4.3 DEV-ΔS3/DEV-ΔTK 基因表達(dá)產(chǎn)物的間接免疫熒光檢測
    2.5 重組病毒 DEV-ΔS3/DEV-ΔTK 生物學(xué)特性的基本研究
        2.5.1 重組病毒 DEV-ΔS3/DEV-ΔTK 的理化特性分析
        2.5.2 重組病毒 DEV-ΔS3/DEV-ΔTK 的體外穩(wěn)定性分析
        2.5.3 重組病毒 DEV-ΔS3/DEV-ΔTK 與親本病毒生長曲線的繪制
        2.5.4 重組病毒 DEV-ΔS3/DEV-ΔTK 與親本病毒蝕斑直徑大小的比較
    2.6 動物試驗
        2.6.1 免疫分組
        2.6.2 DEV 病毒的超離純化
        2.6.3 咽及泄殖腔棉拭子中基因的檢測
        2.6.4 間接 ELISA 方法檢測鴨血清中抗體消長規(guī)律
        2.6.5 中和抗體效價的測定
        2.6.6 病理組織學(xué)變化
3 結(jié)果與分析
    3.1 重組病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
        3.1.1 重組病毒同源臂基因的擴(kuò)增
        3.1.2 表達(dá)盒基因的獲得
        3.1.3 重組質(zhì)粒的鑒定
        3.1.4 左、右同源臂連接結(jié)果
        3.1.5 缺失病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
        3.1.6 pMD18T-gpt-EGFP 的連接結(jié)果
    3.2 重組病毒的構(gòu)建與篩選
    3.3 重組病毒的鑒定
        3.3.1 重組病毒 DEV-ΔS3 的 PCR 鑒定
        3.3.2 重組病毒 DEV-ΔTK 的 PCR 鑒定
        3.3.3 重組病毒的 IIF 檢測
    3.4 重組病毒 DEV-ΔS3/DEV-ΔTK 生物學(xué)特性的基本研究
        3.4.1 重組病毒 DEV-ΔS3/DEV-ΔTK 的理化特性分析
        3.4.2 重組病毒 DEV-ΔS3/DEV-ΔTK 的體外穩(wěn)定性分析
        3.4.3 重組病毒 DEV-ΔS3/DEV-ΔTK 生長曲線的繪制
        3.4.4 重組病毒 DEV-ΔS3/DEV-ΔTK 與親本病毒蝕斑直徑大小的比較
    3.5 動物試驗
        3.5.1 咽及泄殖腔棉拭子中基因的檢測
        3.5.2 間接 ELISA 方法檢測鴨血清中抗體消長規(guī)律
        3.5.3 中和抗體效價的測定
        3.5.4 病理組織學(xué)變化
4 討論
    4.1 DEV 缺失病毒的構(gòu)建
        4.1.1 構(gòu)建 DEV 缺失病毒的意義
        4.1.2 缺失位點的選擇
        4.1.3 重組病毒篩選方法的選擇
    4.2 重組病毒的鑒定
    4.3 重組病毒 DEV-ΔS3/DEV-ΔTK 生物學(xué)特性的基本研究
    4.4 動物試驗結(jié)果的分析
        4.4.1 重組病毒的安全性
        4.4.2 血清抗體效價的測定
        4.4.3 中和抗體效價的測定
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士期間發(fā)表的論文



本文編號：3758445