本文關(guān)鍵詞：弓形蟲ROP18和SAG1乳酸桿菌活載體疫苗株的構(gòu)建及其免疫效果評價，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：弓形蟲病(Toxoplasmosis)是一種全球分布的人獸共患寄生蟲病,其病原為剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii),嚴(yán)重危害人畜健康。該病的流行,不但給畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失,也帶來嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。弓形蟲是細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲,目前還沒有治療弓形蟲病的特效藥物,因此盡快研制安全有效的弓形蟲疫苗對防止該病的傳播有重要意義。乳酸菌以其獨特的益生作用常作為活載體的首選菌。本研究首次將弓形蟲基因ROP18和SAG1連接到pSIP409載體上,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pSIP409-ROP18和pSIP409-SAG1,檢測其在乳酸桿菌Nc8中的表達(dá)情況,最終將表達(dá)弓形蟲ROP18和SAG1重組乳酸桿菌免疫小白鼠,然后檢測其誘導(dǎo)的黏膜免疫的保護效果。具體研究方法和結(jié)果如下:1.弓形蟲基因ROP18和SAG1原核表達(dá)載體的構(gòu)建及重組乳酸桿菌的制備從弓形蟲RH株中擴增出ROP18和SAG1基因,與大腸桿菌-乳酸桿菌穿梭表達(dá)載體pSIP409進(jìn)行連接,并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入乳酸桿菌Nc8中,通過重組質(zhì)粒酶切和PCR鑒定篩選出陽性菌落,然后對陽性菌進(jìn)行SppIP誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測,結(jié)果表明,在67kDa和39kDa處有陽性條帶。2.重組乳酸桿菌免疫小白鼠以及免疫效果的檢測將小白鼠分為5組(pSIP409-ROP18-Nc8,pSIP409-SAG1-Nc8,pSIP409-Nc8,乳和空白對照組),免疫期間采集小白鼠血清樣品、肺臟、和小腸的沖洗液進(jìn)行ELISA檢測,檢測血清IgG的含量,檢測肺臟和小腸沖洗液中sIgA的含量,用流式細(xì)胞儀檢測脾淋巴細(xì)胞中CD4+、CD8+的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,兩組重組乳酸桿菌免疫組抗體水平高于其他三組,CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞含量增多,脾淋巴細(xì)胞在抗原刺激后增殖,但差異不顯著。以上結(jié)果表明,重組質(zhì)粒pSIP409-ROP18和pSIP409-SAG1在乳酸桿菌Nc8中獲得了表達(dá),并且免疫動物后增強了動物的免疫功能,但表達(dá)量較少,需進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)條件。本次試驗首次成功構(gòu)建了弓形蟲乳酸桿菌活載體疫苗pSIP409-ROP18-Nc8和pSIP409-SAG1-Nc8,并成功在乳酸桿菌Nc8中表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物具有一定的免疫原性,但是表達(dá)量較少。用該疫苗免疫小白鼠后,對小白鼠產(chǎn)生了一定的保護力,但是免疫效果不是很好,需要更進(jìn)一步的研究,該研究為預(yù)防弓形蟲病的活載體疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：弓形蟲病 活載體疫苗 ROP18 SAG1 乳酸桿菌 黏膜免疫
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4
【目錄】：

• 摘要3-4
• Summary4-8
• 主要縮略詞英漢對照表8-10
• 第一章 引言10-15
• 1.1 弓形蟲病10
• 1.2 黏膜免疫系統(tǒng)概述10
• 1.3 活載體疫苗10-11
• 1.3.1 乳酸菌和乳酸桿菌的益生作用11
• 1.3.2 乳酸桿菌活載體疫苗的優(yōu)點11
• 1.4 弓形蟲病疫苗的研究進(jìn)展11-14
• 1.4.1 滅活疫苗12
• 1.4.2 弱毒疫苗12
• 1.4.3 DNA疫苗12-13
• 1.4.4 基因缺失疫苗13
• 1.4.5 亞單位疫苗13
• 1.4.6 活載體疫苗13-14
• 1.5 總結(jié)與展望14-15
• 第二章 弓形蟲重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建15-27
• 2.1 材料與方法15-24
• 2.1.1 材料15-18
• 2.1.1.1 工具酶和主要試劑15
• 2.1.1.2 主要儀器設(shè)備15-16
• 2.1.1.3 主要試劑16
• 2.1.1.4 試劑配制16-17
• 2.1.1.5 引物17-18
• 2.1.2 方法18-24
• 2.1.2.1 DNA的提取18
• 2.1.2.2 PCR擴增ROP18和SAG1基因的PCR擴增體系18-19
• 2.1.2.3 ROP18和SAG1基因PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳分析19
• 2.1.2.4 ROP18和SAG1基因PCR擴增產(chǎn)物的凝膠回收和純化19-20
• 2.1.2.5 ROP18和SAG1基因PCR擴增產(chǎn)物的連接20
• 2.1.2.6 重組質(zhì)粒ROP18/T、SAG1/T的轉(zhuǎn)化20-21
• 2.1.2.7 提取重組質(zhì)粒T-ROP18、T-SAG121
• 2.1.2.8 感受態(tài)細(xì)胞（JM109）的制備21
• 2.1.2.9 重組質(zhì)粒T-ROP18、T-SAG1在感受態(tài)細(xì)胞（JM109）中的轉(zhuǎn)化21-22
• 2.1.2.10 菌液PCR鑒定22
• 2.1.2.11 提取表達(dá)載體質(zhì)粒p SIP40922
• 2.1.2.12 ROP18、SAG1基因和p SIP409表達(dá)載體雙酶切片段的回收22
• 2.1.2.13 重組質(zhì)粒p SIP409-ROP18和p SIP409-SAG1的構(gòu)建22-23
• 2.1.2.14 目的基因ROP18、SAG1與p SIP409質(zhì)粒的連接23-24
• 2.1.2.15 重組質(zhì)粒p SIP409-ROP18、p SIP409-SAG1的轉(zhuǎn)化24
• 2.1.2.16 重組質(zhì)粒p SIP409-ROP18、p SIP409-SAG1的PCR鑒定24
• 2.1.2.17 重組質(zhì)粒p SIP409-ROP18、p SIP409-SAG1的提取24
• 2.1.2.18 重組質(zhì)粒p SIP409-ROP18、p SIP409-SAG1的雙酶切鑒定24
• 2.2 結(jié)果24-25
• 2.2.1 目的基因的鑒定結(jié)果24-25
• 2.3 討論25-27
• 第三章 弓形蟲重組表達(dá)質(zhì)粒在乳酸桿菌Nc8中的表達(dá)27-35
• 3.1 材料與方法27-32
• 3.1.1 材料27-30
• 3.1.1.1 菌種27
• 3.1.1.2 主要儀器設(shè)備27
• 3.1.1.3 試劑的配置27-30
• 3.1.2 方法30-32
• 3.1.2.1 乳酸菌Nc8感受態(tài)的制備30
• 3.1.2.2 乳酸菌的電轉(zhuǎn)化30-31
• 3.1.2.3 乳酸菌質(zhì)粒的提取31
• 3.1.2.4 重組乳酸菌的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析31-32
• 3.1.2.5 重組乳酸菌Western blot分析32
• 3.2 結(jié)果32-34
• 3.2.1 重組乳酸桿菌菌液PCR鑒定32-33
• 3.2.2 重組乳酸桿菌的SDS-PAGE結(jié)果鑒定33
• 3.2.3 重組乳酸桿菌的Western blot結(jié)果鑒定33-34
• 3.3 討論34-35
• 3.3.1 電轉(zhuǎn)化方法的確定34
• 3.3.2 重組乳酸桿菌表達(dá)蛋白的條件優(yōu)化34
• 3.3.3 重組乳酸桿菌的SDS-PAGE和Western blot結(jié)果分析34-35
• 第四章 重組乳酸桿菌對小白鼠黏膜免疫的效果研究35-47
• 4.1 材料與方法35-39
• 4.1.1 材料35-36
• 4.1.1.1 試驗動物35
• 4.1.1.2 主要儀器及設(shè)備35
• 4.1.1.3 主要試劑及配制方法35-36
• 4.1.2 方法36-39
• 4.1.2.1 試驗動物分組及免疫36
• 4.1.2.2 小鼠血清的制備36
• 4.1.2.3 小鼠肺臟和小腸浸出液的制備36
• 4.1.2.4 血清中Ig G抗體及Ig G1、Ig G2a抗體亞類的檢測36-37
• 4.1.2.5 試驗小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液的制備37-38
• 4.1.2.6 試驗小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗（MTT法）38
• 4.1.2.7 細(xì)胞因子IFN-γ、IL2、IL4和IL10的檢測38
• 4.1.2.8 脾臟CD3+CD4+CD8-和CD3+CD8+CD4-細(xì)胞的檢測38-39
• 4.1.2.9 肺臟和小腸中s Ig A的檢測39
• 4.1.2.10 免疫保護力試驗-----腹腔注射感染弓形蟲RH珠39
• 4.2 結(jié)果39-45
• 4.2.1 試驗鼠血清中抗體Ig G和抗體亞類Ig G1、Ig G2a的分布情況39-41
• 4.2.1.1 免疫期間試驗鼠血清中Ig G的分布情況39-40
• 4.2.1.2 試驗鼠血清中Ig G1、Ig G2a的分布情況40-41
• 4.2.2 脾淋巴細(xì)胞增殖試驗的結(jié)果41
• 4.2.3 細(xì)胞因子IFN-γ、IL2、IL4、IL10的檢測41-43
• 4.2.3.1 細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制41-42
• 4.2.3.2 各細(xì)胞因子檢測結(jié)果42-43
• 4.2.3.2.1 IFN-γ檢測結(jié)果42
• 4.2.3.2.2 IL2檢測結(jié)果42
• 4.2.3.2.3 IL4檢測結(jié)果42
• 4.2.3.2.4 IL10檢測結(jié)果42-43
• 4.2.4 流式細(xì)胞分選儀分析CD3+CD4+CD8-和CD3+CD8+CD4-細(xì)胞43-44
• 4.2.5 肺臟和小腸中s Ig A的檢測結(jié)果44-45
• 4.2.6 試驗鼠腹腔注射弓形蟲RH株的效果評價45
• 4.3 討論45-47
• 第五章 全文結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-54
• 致謝54-55
• 作者簡歷55-56
• 導(dǎo)師簡介56-58

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1 倪曉婷;弓形蟲ROP18和SAG1乳酸桿菌活載體疫苗株的構(gòu)建及其免疫效果評價[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

  本文關(guān)鍵詞：弓形蟲ROP18和SAG1乳酸桿菌活載體疫苗株的構(gòu)建及其免疫效果評價，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：366019