本文關鍵詞：miR-449a對LGR4在奶山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞中靶向調(diào)控作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：mi RNAs是一類小的非編碼RNA,以特定的序列調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄后表達。miR-449a可以誘導細胞凋亡和分化,LGR4可以調(diào)控生殖細胞的分化。本課題組前期的高通量測序數(shù)據(jù)結(jié)果表明,miR-449a在奶山羊子宮內(nèi)膜容受期的相對表達量與非容受期相比極顯著升高(P0.01),而LGR4的表達量則顯著降低(P0.05)。生物信息學分析表明,LGR4為miR-449a的靶基因。因此研究miR-449a對LGR4在奶山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞(ESC)中的靶向調(diào)控作用對闡明奶山羊子宮內(nèi)膜容受性形成的分子機理具有重要意義。本研究以西農(nóng)薩能奶山羊為研究對象,利用stem-loop RT-qPCR和RT-qPCR檢測mi R-449a和LGR4在奶山羊子宮內(nèi)膜容受期和非容受期的差異性表達,通過雙熒光素酶報告載體系統(tǒng)、RT-qPCR、Western blot、MTT、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測以及細胞周期分析等技術(shù),研究miR-449a對靶基因LGR4的調(diào)控,檢測miR-449a對ESC的影響以及對P53、Bcl-2和FAS的表達調(diào)控作用。本研究主要取得的結(jié)果如下:1.通過stem-loop RT-qPCR和RT-qPCR分別驗證mi R-449a和LGR4在奶山羊子宮內(nèi)膜容受期和非容受期的相對表達量。結(jié)果表明,與非容受期相比,miR-449a在子宮內(nèi)膜容受期顯著高表達(P0.05),而LGR4 mRNA則顯著低表達(P0.05)。2.構(gòu)建野生型psiCHECK2-LGR4-3′UTR-WT和突變型psiCHECK2-LGR4-3′UTR-Mut雙熒光素酶載體,分別與mi R-449a mimic、miR-449a inhibitor、Negative control(NC)和Negative control inhibitor(NCH)共轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中。結(jié)果顯示,與mi R-449a共轉(zhuǎn)染的試驗組的熒光素酶活性顯著低于Negative control對照組(P0.05),表明mi R-449a通過與LGR4-3′UTR相互作用導致熒光素酶活性降低,初步鑒定LGR4為mi R-449a的靶基因。3.將miR-449a轉(zhuǎn)染到ESC和HEK293T細胞中,通過RT-qPCR和Western blot檢測LGR4在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上的表達,結(jié)果顯示miR-449a在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上抑制了靶基因LGR4的表達。結(jié)果表明,miR-449a負調(diào)控靶基因LGR4的表達。4.mi R-449a轉(zhuǎn)染ESC后,通過MTT法、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測、細胞周期分析等技術(shù)檢測miR-449a對ESC的影響,結(jié)果顯示,miR-449a使ESC停滯在S期(39.09%Vs 36.13%),且miR-449a抑制ESC的增殖,并誘導ESC凋亡。mi R-449a下調(diào)P53在ESC中的表達,抑制FASmRNA的表達,但不影響B(tài)cl-2的表達。由試驗結(jié)果可知,miR-449a可能通過FAS介導的通路誘導ESC凋亡。
【關鍵詞】：奶山羊 子宮內(nèi)膜容受性 miR-449a LGR4 子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S827
【目錄】：

• 摘要5-7
• abstract7-11
• 文獻綜述11-21
• 第一章 miRNA對子宮內(nèi)膜容受性形成的研究進展11-21
• 1.1 子宮內(nèi)膜的研究進展11-15
• 1.1.1 子宮的結(jié)構(gòu)和功能11
• 1.1.2 子宮內(nèi)膜的結(jié)構(gòu)11-12
• 1.1.2 子宮內(nèi)膜的功能12-13
• 1.1.3 子宮內(nèi)膜細胞的概述13-14
• 1.1.4 子宮內(nèi)膜容受性研究進展14
• 1.1.5 子宮內(nèi)膜容受性對胚胎植入的作用14-15
• 1.2 miR-449a的研究進展15-17
• 1.2.1 miRNA的研究進展15-16
• 1.2.2 mi R-449家族的研究概述16-17
• 1.2.3 mi R-449a的研究進展17
• 1.3 LGR4的研究進展17-19
• 1.3.1 LGR家族的研究概況17-18
• 1.3.2 LGR4的研究概述18-19
• 1.3.3 LGR4的信號傳導途徑概述19
• 1.3.4 LGR4在子宮內(nèi)膜容受性形成中的研究19
• 1.4 本研究的目的與意義19-21
• 試驗研究21-49
• 第二章 miR-449a對LGR4在奶山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的靶向調(diào)控作用21-49
• 2.1 引言21
• 2.2 材料和方法21-34
• 2.2.1 材料和試劑21-22
• 2.2.2 方法22-34
• 2.3 結(jié)果與分析34-45
• 2.3.1 mi R-449a和LGR4在奶山羊子宮內(nèi)膜容受期和非容受期的差異性表達34-36
• 2.3.2 mi R-449a靶基因LGR4的預測36
• 2.3.3 psiCHECK2-LGR4-3′UTR雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建與檢測36-38
• 2.3.4 奶山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞（ESC）鑒定38
• 2.3.5 mi R-449a調(diào)控LGR4在ESC中的表達38-40
• 2.3.6 mi R-449a對ESC增殖、凋亡及細胞周期的檢測40-45
• 2.4 討論45-49
• 結(jié)論49-50
• 創(chuàng)新點50
• 進一步研究問題50-51
• 參考文獻51-61
• 附錄61-68
• 致謝68-69
• 作者簡介69

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