本文關(guān)鍵詞：細胞網(wǎng)格蛋白和內(nèi)體酸化對輪狀病毒侵入的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：輪狀病毒(Rotavirus,RV)引起的疾病是一種人畜共患傳染病,主要感染5歲以下兒童及幼齡動物,以脫水性胃腸炎為特征,嚴重時可導(dǎo)致死亡。輪狀病毒造成了巨大的社會負擔(dān)及經(jīng)濟損失,但輪狀病毒的治療尚無特效藥。當(dāng)前兩個商品化口服活疫苗雖在發(fā)達國家效果較好,但在低收入國家免疫效果不好,安全性也存在爭議。因此,開發(fā)特效治療輪狀病毒的藥物和生產(chǎn)高效的疫苗迫在眉睫。輪狀病毒侵入宿主細胞的機制尚不明確,研究出輪狀病毒侵入宿主細胞的機制是必要的,為藥物和疫苗的研發(fā)提供借鑒。本實驗以牛輪狀病毒UK株為模板,原核表達VP6基因的編碼區(qū)全序列。并與弗氏佐劑乳化后免疫豚鼠,分離血清,制備豚鼠抗VP6蛋白的多克隆抗體,檢測多克隆抗體的特性。用蔗糖或NH4Cl處理Caco-2細胞,并設(shè)置非處理組,確定網(wǎng)格蛋白受到破壞或內(nèi)體酸化受到抑制,孵育輪狀病毒UK株或RRV株,通過間接免疫熒光實驗檢測病毒的感染是否受到抑制。另一實驗通過熒光定量PCR的方法定量VP6的轉(zhuǎn)錄差異。實驗結(jié)果成功制備抗VP6多克隆抗體,具有良好的反應(yīng)性,均可以與UK、RRV株輪狀病毒反應(yīng)。蔗糖處理Caco-2和MA104細胞,破壞了細胞的網(wǎng)格蛋白,間接免疫熒光證明,與非處理組相比,UK組輪狀病毒顆粒數(shù)量明顯減少,RRV組輪狀病毒顆粒數(shù)量未有明顯改變,這一結(jié)果表明UK株輪狀病毒侵入細胞依賴于網(wǎng)格蛋白,RRV株輪狀病毒的侵入并不依賴于網(wǎng)格蛋白。NH4Cl處理Caco-2和MA104細胞,抑制細胞的內(nèi)體酸化,間接免疫熒光中與非處理組相比,UK組病毒顆粒數(shù)量明顯減少,RRV組病毒顆粒數(shù)量未有明顯改變,這一結(jié)果表明UK株輪狀病毒侵入細胞依賴于內(nèi)體,RRV株輪狀病毒的侵入并不依賴于內(nèi)體的酸化。另一組實驗,經(jīng)蔗糖和NH4Cl處理的Caco-2細胞或MA104細胞,接種輪狀病毒后,實時定量PCR表明,UK株VP6基因含量與對照組相比顯著下降,RRV株VP6基因含量與對照組相比略有差異。在Caco-2細胞和MA104細胞上得出的結(jié)果一致。綜上所述,無論在易感輪狀病毒的MA104細胞上,還是模擬小腸天然環(huán)境上皮細胞的Caco-2細胞上,UK株輪狀病毒侵入細胞依賴于網(wǎng)格蛋白和內(nèi)體的酸化,而RRV株輪狀病毒的侵入并不依賴于網(wǎng)格蛋白和內(nèi)體的酸化。本結(jié)論對闡明輪狀病毒侵入機制具有重要意義,也為輪狀病毒胃腸炎藥物的開發(fā)提供參考。
【關(guān)鍵詞】：輪狀病毒 網(wǎng)格蛋白 多克隆抗體 VP6基因 內(nèi)體 侵入
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要4-5
• abstract5-11
• 第一章 文獻綜述11-27
• 1.1 引言11
• 1.2 輪狀病毒分類及主要結(jié)構(gòu)蛋白11-14
• 1.2.1 分類11-12
• 1.2.2 主要結(jié)構(gòu)蛋白12-14
• 1.3 輪狀病毒分子流行病學(xué)14-16
• 1.3.1 人輪狀病毒流行病學(xué)14-15
• 1.3.2 動物輪狀病毒流行病學(xué)15-16
• 1.4 輪狀病毒的臨診癥狀、診斷、治療及防控16-17
• 1.4.1 輪狀病毒臨診癥狀16
• 1.4.2 輪狀病毒的診斷16
• 1.4.3 輪狀病毒的疾病治療16
• 1.4.4 輪狀病毒疾病的防控16-17
• 1.5 輪狀病毒受體17-22
• 1.5.1 唾液酸18-19
• 1.5.2 整合素19-21
• 1.5.3 熱休克蛋白hsc7021-22
• 1.5.4 脂筏22
• 1.6 輪狀病毒侵入細胞的復(fù)雜過程22-24
• 1.7 病毒侵入細胞的機制24-25
• 1.8 研究的意義25-27
• 第二章 輪狀病毒VP6多克隆抗體的制備27-49
• 2.1 材料27-28
• 2.1.1 病毒、細胞、質(zhì)粒及菌株27
• 2.1.2 實驗動物27
• 2.1.3 主要試劑27
• 2.1.4 主要儀器設(shè)備27-28
• 2.2 方法28-39
• 2.2.1 引物的設(shè)計與合成28
• 2.2.2 細胞培養(yǎng)及輪狀病毒UK株的擴增28-29
• 2.2.3 TRIzol法提取RNA29
• 2.2.4 反轉(zhuǎn)錄29-30
• 2.2.5 PCR30
• 2.2.6 輪狀病毒UK株VP6基因亞克隆30-32
• 2.2.7 堿裂解法小量提取質(zhì)粒32-33
• 2.2.8 重組質(zhì)粒的鑒定33-34
• 2.2.9 重組質(zhì)粒在大腸桿菌的表達34-35
• 2.2.10 重組蛋白的大量表達及純化35-36
• 2.2.11 純化后蛋白的濃縮36
• 2.2.12 濃縮后蛋白的定量36-37
• 2.2.13 純化后蛋白的Western-blotting分析37
• 2.2.14 多克隆抗體的制備37-38
• 2.2.15 多克隆抗體的檢測38-39
• 2.3 結(jié)果39-46
• 2.3.1 輪狀病毒UK株VP6基因的擴增39-40
• 2.3.2 重組質(zhì)粒的鑒定40
• 2.3.3 輪狀病毒VP6表達產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果分析40-41
• 2.3.4 純化后重組蛋白的Glycine-SDS-PAGE分析41-42
• 2.3.5 Western blotting結(jié)果分析42
• 2.3.6 Western blotting檢測多克隆抗體的反應(yīng)性42-43
• 2.3.7 ELISA檢測多克隆抗體的效價43-44
• 2.3.8 間接免疫熒光檢測抗體與病毒的反應(yīng)性44-46
• 2.4 討論46-49
• 第三章 網(wǎng)格蛋白和內(nèi)體酸化對輪狀病毒侵入的影響49-67
• 3.1 材料49
• 3.1.1 主要試劑49
• 3.1.2 病毒及細胞49
• 3.1.3 主要儀器設(shè)備49
• 3.2 方法49-52
• 3.2.1 病毒的濃縮49-50
• 3.2.2 間接免疫熒光實驗50-51
• 3.2.3 熒光定量PCR51-52
• 3.3 結(jié)果52-65
• 3.3.1 網(wǎng)格蛋白被抑制結(jié)果52-53
• 3.3.2 抑制網(wǎng)格蛋白對輪狀病毒侵入的影響53-57
• 3.3.3 抑制內(nèi)體酸化對輪狀病毒侵入的影響57-61
• 3.3.4 實時定量PCR結(jié)果61-65
• 3.4 討論65-67
• 第四章 全文結(jié)論67-69
• 參考文獻69-79
• 致謝79-81
• 個人簡歷81

【參考文獻】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李躍;兒童輪狀病毒腹瀉的分子流行病學(xué)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：細胞網(wǎng)格蛋白和內(nèi)體酸化對輪狀病毒侵入的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：359844