本文關(guān)鍵詞：CR4介導牛溶血性曼氏桿菌LKT誘導細胞毒性作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：溶血性曼氏桿菌(Mannheimia haemolytica)是牛呼吸道疾病綜合癥(Bovine respiratory disease complex,BRDC)中重要的細菌性病原之一,引起牛、羊等反芻動物的上呼吸道感染、支氣管肺炎及纖維素性肺炎。在疾病的發(fā)生過程中白細胞毒素(Leukotoxin,LKT)是溶血性曼氏桿菌最重要的毒力因子之一,能夠識別白細胞表面的特異性受體,引起細胞凋亡和細胞溶解。已證實的受體有β2整合素成員LFA-1(CD11a/CD18)和Mac-1(CD11b/CD18)。也有研究表明β2整合素成員CR4(CD11c/CD18)是羊感染溶血性曼氏桿菌過程中的白細胞受體,但在牛感染溶血性曼氏桿菌過程中是否也是其LKT的特異性受體呢?本研究在牛源溶血性曼氏桿菌LKT生物學特性研究的基礎(chǔ)上,擴增牛源單核細胞CD11c和CD18的基因序列,并開展了LKT與CR4之間的研究,為進一步深入研究溶血性曼氏桿菌致病機制提供了參考。研究內(nèi)容如下:首先,應(yīng)用MTT法比較分析了粗提和純化的LKT對牛外周血中性粒細胞增殖的影響,檢測毒素活性。隨后,根據(jù)GeneBank上公布的牛源CD18基因序列(M81233.1)設(shè)計CD18引物,參考羊(FJ601824.1)及水牛(XM_006070380.1)的CD11c基因序列,分段設(shè)計2對CD11c引物。以提取的單核細胞總RNA為模板,PCR擴增本地黃牛、荷斯坦奶牛的CD18和CD11c基因。CD18基因克隆至T載體,再EcoR I和Xba I雙酶切連接至pCI-neo真核表達載體,構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pCI-neo-CD18。通過Hind III和Xho I雙酶切連接至pcDNA3.1(+)真核表達載體,構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-CD11c。并對奶牛CD11c進行信號肽、跨膜區(qū)和蛋白結(jié)構(gòu)預測。建立瞬時表達奶牛CD18、CD11c和CR4(CD11c/CD18)的293T細胞系,采用間接免疫熒光、RT-PCR和Western Blot等方法驗證奶牛CD18、CD11c和CR4蛋白的表達情況。最后,用純化的LKT感染表達CD18、CD11c和CR4蛋白的293T細胞系,MTT檢測細胞毒性,以293T細胞作為陰性對照。結(jié)果表明:純化的LKT分子量大約100 kD左右。構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pCI-neo-CD18,測得CD18序列全長2310 bp,編碼758個氨基酸,奶牛、黃牛的CD18基因與GeneBank上公布的序列同源性分別為100%和96.1%。構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-CD11c,測得CD11c序列全長3477 bp,編碼1158個氨基酸。奶牛和黃牛與GeneBank上公布的水牛、羊CD11c基因的核甘酸序列同源性分別為97.5%、95.5%和97.2%、95.2%。預測的奶牛CD11c蛋白N-末端前19個氨基酸殘基為信號肽,是一次性跨膜蛋白。轉(zhuǎn)染奶牛CD11c、CD18和共轉(zhuǎn)染CR4(CD11c/CD18)至293T細胞后,間接免疫熒光,RT-PCR,Western Blot結(jié)果證實了CD11c、CD18和CR4蛋白均可在所構(gòu)建的293T細胞系表達。MTT方法證明LKT誘導轉(zhuǎn)染CR4的293T細胞毒性,證明CR4是LKT誘導細胞溶解的特異性受體。總之,研究證明了荷斯坦奶牛和本地黃牛外周血單核細胞表面具有CR4(CD11c/CD18)受體;首次獲得奶牛CD11c核苷酸序列,序列長3477 bp,編碼1159個氨基酸。初步探討了荷斯坦奶牛單核細胞CR4是介導溶血性曼氏桿菌白細胞毒素LKT誘導細胞毒性作用的受體。為今后研究能夠阻斷毒力因子LKT與白細胞受體相互作用的藥物及疫苗提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：牛 溶血性曼氏桿菌 白細胞毒素 CD11c CD18 CR4
【學位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 文獻綜述12-26
• 1.1 溶血性曼氏桿菌感染概述12-13
• 1.1.1 溶血性曼氏桿菌生物學特性12-13
• 1.1.2 臨床癥狀13
• 1.2 溶血性曼氏桿菌的毒力因子13-20
• 1.2.1 粘附素13-14
• 1.2.2 脂多糖14-15
• 1.2.3 莢膜15-16
• 1.2.4 外膜蛋白16
• 1.2.5 蛋白酶16-17
• 1.2.6 白細胞毒素（LKT）17-20
• 1.3 β2 整合素受體研究進展20-24
• 1.3.1 β2 整合素的組成、分布和結(jié)構(gòu)20-22
• 1.3.2 整合素LFA 1（CD11a/CD18;αLβ2）22-23
• 1.3.3 整合素Mac 1（CD11b/CD18；αMβ2；Mo 1）23
• 1.3.4 整合素CR4（CD11c/CD18；p150，95；αXβ2）23-24
• 1.4 研究目的和意義24-26
• 第二章 溶血性曼氏桿菌白細胞毒素（LKT）的提取及其活性研究26-34
• 2.1 材料26-27
• 2.1.1 細菌菌株26
• 2.1.2 主要生化試劑26
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備及來源26-27
• 2.2 方法27-29
• 2.2.1 細菌的復蘇培養(yǎng)27
• 2.2.2 主要生物學特性檢測27
• 2.2.3 白細胞毒素制備27
• 2.2.4 超濾濃縮27
• 2.2.5 SDS PAGE27-28
• 2.2.6 白細胞毒素活性的測定28-29
• 2.3 結(jié)果29-31
• 2.3.1 細菌培養(yǎng)特性及生化試驗結(jié)果29-30
• 2.3.2 SDS PAGE結(jié)果30
• 2.3.3 白細胞毒素活性檢測結(jié)果30-31
• 2.4 討論與小結(jié)31-34
• 第三章 β2 整合素CD11c和CD18的克隆及真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建34-56
• 3.1 材料34-35
• 3.1.1 細菌菌株和質(zhì)粒載體34
• 3.1.2 工具酶與主要生化試劑34
• 3.1.3 試劑盒及其他34
• 3.1.4 主要儀器設(shè)備及來源34-35
• 3.2 方法35-41
• 3.2.1 奶牛和黃牛單核細胞的分離35
• 3.2.2 總RNA的提取及cDNA的合成35-37
• 3.2.3 CD18和CD11c的PCR產(chǎn)物的膠回收37
• 3.2.4 重組質(zhì)粒pGME T easy CD18的構(gòu)建37-38
• 3.2.5 質(zhì)粒的制備與鑒定38
• 3.2.6 pGEM Teasy CDl8基因測序38-39
• 3.2.7 真核表達質(zhì)粒pCI neo CD18的構(gòu)建39-40
• 3.2.8 真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1 CD11c的構(gòu)建40
• 3.2.9 奶牛與黃牛的CD11c和CD18序列分析40-41
• 3.2.10 CD11c蛋白結(jié)構(gòu)預測41
• 3.3 結(jié)果41-52
• 3.3.1 CD18基因的PCR擴增結(jié)果41
• 3.3.2 CD18基因T A克隆的PCR及雙酶切鑒定結(jié)果41-42
• 3.3.3 pCI neo CD18真核表達質(zhì)粒鑒定結(jié)果42-43
• 3.3.4 CD18基因的序列分析結(jié)果43-44
• 3.3.5 CD11c基因PCR擴增結(jié)果44-45
• 3.3.6 pcDNA3.1 CD11c真核表達質(zhì)粒鑒定結(jié)果45
• 3.3.7 CD11c蛋白生物信息學分析45-52
• 3.4 討論與小結(jié)52-56
• 第四章 LKT結(jié)合表達CD18，CD11c和CR4的 293T細胞系56-68
• 4.1 材料56-57
• 4.1.1 細菌菌株和質(zhì)粒載體56
• 4.1.2 工具酶與主要生化試劑56
• 4.1.3 試劑盒及其他56
• 4.1.4 主要儀器設(shè)備及來源56-57
• 4.2 方法57-60
• 4.2.1 293T細胞的復蘇和活化57
• 4.2.2 293T細胞的傳代57
• 4.2.3 質(zhì)粒的瞬時轉(zhuǎn)染57-58
• 4.2.4 間接免疫熒光檢測CD18，CD11c和CR4蛋白的表達58
• 4.2.5 RT PCR檢測CD18，CD11c和CR4蛋白的表達58
• 4.2.6 Western Blot檢測CD18，CD11c和CR4蛋白的表達58-59
• 4.2.7 MTT分析LKT誘導細胞毒性作用59-60
• 4.3 結(jié)果60-64
• 4.3.1 間接免疫熒光檢測CD11c，CD18和CR4蛋白表達結(jié)果60-61
• 4.3.2 RT PCR檢測HEK 293T細胞表達CD11c，CD18和CR4蛋白61-62
• 4.3.3 Western Blot分析表達CD11c，CD18和CR4蛋白的結(jié)果62-63
• 4.3.4 MTT檢測LKT分別感染表達CD18、CD11c和CR4的細胞活性63-64
• 4.4 討論與小結(jié)64-68
• 第五章 全文結(jié)論68-70
• 參考文獻70-88
• 致謝88-90
• 附錄90-92
• 個人簡歷92

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 王萍萍;高銳;張偉;黃艷;;曼氏桿菌病(Mannheimiosis)[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2007年10期

2 張永久;王萍萍;武廣文;;溶血性曼氏桿菌毒素的作用及其分子致病機理[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2007年07期

3 完馬單智;防治牛出敗病的體會[J];青海畜牧獸醫(yī)雜志;2003年02期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳立志;牛源致病性壞死梭桿菌分離鑒定及其白細胞毒素免疫特性研究[D];吉林大學;2008年

  本文關(guān)鍵詞：CR4介導牛溶血性曼氏桿菌LKT誘導細胞毒性作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：359561