發(fā)布時間：2017-05-10 13:02

  本文關鍵詞：犬狂犬病病毒抗體液態(tài)芯片檢測方法研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：狂犬病是由親神經(jīng)性狂犬病病毒引起的一種高度致死性人獸共患病,幾乎可以感染所有的溫血脊椎動物,病死率約為100%。對于寵物犬和普通實驗犬而言,需定期檢測血清中狂犬病病毒抗體水平,從而進行感染監(jiān)測和免疫效果評價,而無特定病原體實驗犬狂犬病病毒抗體要求必須為陰性。目前,常規(guī)的檢測狂犬病血清抗體水平的方法均無法實現(xiàn)狂犬病與其他犬常見病毒性傳染病的同時檢測。液態(tài)芯片是一種新型的高通量檢測技術,可以對同一樣品中多種不同生物分子進行檢測,與多種病原體或抗體分別檢測相比,不僅節(jié)省了很多時間,而且大大提高了樣品的利用率。本研究通過狂犬病病毒糖蛋白的表達和B細胞線性抗原表位預測及合成兩種途徑制備狂犬病病毒糖蛋白人工抗原。狂犬病病毒糖蛋白基因工程抗原的制備采用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng):利用RT-PCR方法擴增糖蛋白基因,亞克隆至p MD18-T載體,經(jīng)PCR和測序鑒定后,成功構建了重組克隆質(zhì)粒p MD18T-SRV9G;將SRV9G基因再次克隆到p Fast Bac Dual質(zhì)粒上,經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定后,成功構建了重組供體質(zhì)粒p Fast Bac Dual-SRV9G;重組供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細胞,挑取白色克隆進行PCR鑒定,結(jié)果表明成功構建了重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-SRV9G;鑒定正確的重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細胞,觀察細胞病變,收獲并擴增重組桿狀病毒,并對其進行負染電鏡觀察,結(jié)果表明重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染成功;通過SDS-PAGE和Western blot檢測重組桿狀病毒的表達,結(jié)果顯示Sf9細胞成功表達了狂犬病病毒糖蛋白�？袢〔《咎堑鞍卓乖砦活A測:通過對糖蛋白的基本性質(zhì)和二級結(jié)構分析,結(jié)合DNAStar、在線分析工具Bepipred和ABCpred預測得到8段可能性較大的B細胞線性抗原表位,篩選部分序列后合成,用于液態(tài)芯片方法的建立。本研究將狂犬病病毒糖蛋白及其B細胞線性抗原表位TG16-1、TG16-2、GS-12、DG-14分別偶聯(lián)到磁性羧基微球上制備捕獲微球,檢測相同的陰性和陽性血清進行評價。初步篩選出用于液態(tài)芯片檢測的抗原為狂犬病病毒糖蛋白和表位多肽TG16-1。將表位多肽TG16-1分別偶聯(lián)到磁性熒光微球和聚苯乙烯熒光微球制備捕獲微球,檢測相同的血清,結(jié)果發(fā)現(xiàn)聚苯乙烯熒光微球效果比磁性熒光微球效果好。以巰基聚苯乙烯微球為載體,分別偶聯(lián)狂犬病病毒糖蛋白和表位多肽TG16-1,制備了兩種不同的捕獲微球。對檢測過程中兩種不同的捕獲微球用量、PE標記羊抗犬Ig G濃度、血清孵育時間及PE標記羊抗犬Ig G孵育時間進行了優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果為:狂犬病病毒糖蛋白和表位多肽TG16-1的捕獲微球用量均為1μL,PE標記羊抗犬Ig G反應濃度分別為8μg/m L和4μg/m L,血清孵育時間分別為2 h和1 h,PE標記羊抗犬Ig G孵育時間分別為1h和0.5 h。因表位多肽易合成,純度高,利于成果轉(zhuǎn)化,最終確定檢測抗原為表位多肽TG16-1。對犬狂犬病病毒抗體液態(tài)芯片檢測方法進行特異性和敏感性評價,犬狂犬病病毒抗體液態(tài)芯片與犬瘟熱、犬細小、犬傳染性肝炎陽性血清均無交叉反應;抗體效價最低檢測限為0.41 IU/m L。本研究成功建立了犬狂犬病病毒抗體液態(tài)芯片檢測方法,該方法特異性強,敏感性高,為犬主要病毒性傳染病高通量快速檢測試劑盒的研發(fā)奠定了基礎。
【關鍵詞】：狂犬病病毒糖蛋白 桿狀病毒表達 B細胞線性抗原表位預測 液態(tài)芯片
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文縮寫詞表11-12
• 引言12-13
• 第一篇 文獻綜述13-28
• 第1章 重組蛋白表達系統(tǒng)的研究進展13-22
• 1 原核表達系統(tǒng)13-14
• 2 酵母表達系統(tǒng)14-16
• 3 昆蟲細胞表達系統(tǒng)16-18
• 4 哺乳動物細胞表達系統(tǒng)18-20
• 5 無細胞表達系統(tǒng)20-22
• 第2章 狂犬病的診斷與監(jiān)測技術22-28
• 1 直接快速免疫組化試驗22-23
• 2 快速免疫層析試驗23
• 3 實時熒光定量PCR23-24
• 4 系統(tǒng)發(fā)生生物地理學分析24-25
• 5 蛋白質(zhì)組學分析25-26
• 6 液態(tài)芯片檢測技術26-28
• 第二篇 研究內(nèi)容28-71
• 第1章 狂犬病病毒糖蛋白人工抗原的制備28-57
• 1.1 材料28-31
• 1.2 方法31-43
• 1.3 結(jié)果43-53
• 1.4 討論53-55
• 1.5 小結(jié)55-57
• 第2章 狂犬病病毒抗體液態(tài)芯片檢測方法的建立57-71
• 2.1 材料58-59
• 2.2 方法59-63
• 2.3 結(jié)果63-68
• 2.4 討論68-70
• 2.5 小結(jié)70-71
• 結(jié)論71-72
• 參考文獻72-83
• 導師簡介83-84
• 作者簡介84-85
• 致謝85-86

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 朱泰承;李寅;;畢赤酵母表達系統(tǒng)發(fā)展概況及趨勢[J];生物工程學報;2015年06期

2 謝寶明;魏圓圓;喬自林;于國偉;李向茸;馮玉萍;令世鑫;馬忠仁;柏家林;;哺乳動物細胞表達外源基因常用病毒載體的研究進展[J];西北民族大學學報(自然科學版);2015年01期

3 劉振衛(wèi);曲章義;商蕾;高虹;王迎晨;董妥;楊金峰;于惠崧;;人腺病毒55型六鄰體蛋白同源建模及B細胞抗原表位預測[J];哈爾濱醫(yī)科大學學報;2015年01期

4 王宇平;陳永義;張建明;;液相芯片技術在人類傳染病檢測中的應用[J];現(xiàn)代預防醫(yī)學;2015年04期

5 王慶華;高麗麗;梁會超;鞏婷;楊金玲;朱平;;影響畢赤酵母高效表達重組蛋白的主要因素及其研究進展[J];藥學學報;2014年12期

6 靳雯雯;楊曉紅;朱碧波;呂建強;曹勝波;;非洲豬瘟病毒VP73基因在哺乳動物細胞中的表達[J];中國預防獸醫(yī)學報;2014年07期

7 凌同;余黎;白慕群;;昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)的研究進展與應用[J];微生物學免疫學進展;2014年02期

8 張海雷;白換力;薛慧亮;李志萍;蘇紅艷;唐志文;靳朝;夏志平;;犬瘟熱病毒N蛋白的B細胞抗原表位預測[J];中國獸醫(yī)學報;2014年01期

9 朱鵬;李建遠;;液態(tài)芯片的原理及其在臨床診斷中的應用[J];中國保健營養(yǎng);2013年07期

10 勾藍圖;楊金亮;;用于重組蛋白生產(chǎn)的哺乳動物細胞表達新技術[J];生物技術通訊;2012年06期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張緒;無細胞體系高效合成復雜膜蛋白的關鍵技術及工業(yè)應用探索[D];浙江大學;2014年

2 王照;畢赤酵母表達犬長效干擾素融合蛋白的研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學;2013年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張卉卉;利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)表達褐飛虱細胞色素P450基因CYP4CE1[D];湖北大學;2012年

2 王瑞琴;HIV-1中和性抗體在桿狀病毒表達系統(tǒng)的表達[D];西北農(nóng)林科技大學;2012年

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本文編號：354781