本文關(guān)鍵詞：豬肌纖維類(lèi)型關(guān)鍵基因篩選及miR-423-5p的功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：隨著研究的不斷發(fā)展,在轉(zhuǎn)錄組水平的分析能夠更加精確的鑒定基因的結(jié)構(gòu)和功能,RNA-seq深度測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用能夠顯著促進(jìn)人們對(duì)轉(zhuǎn)錄組的認(rèn)識(shí)。然而,關(guān)于豬不同類(lèi)型肌肉的形成機(jī)制和基因調(diào)控的深度分析尚未完全揭示。因此,為全面解析不同類(lèi)型肌肉中的基因表達(dá)模式和作用機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了豬不同類(lèi)型肌肉組織的基因表達(dá)文庫(kù),采用RNA-seq技術(shù)檢測(cè)兩個(gè)文庫(kù)中的基因表達(dá)譜,對(duì)其功能進(jìn)行聚類(lèi),Pathway分析,調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,并進(jìn)行了新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)、基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化、可變剪切分析以及SNP分析。本研究通過(guò)對(duì)不同類(lèi)型肌肉轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)分析發(fā)現(xiàn),基因SUFU在不同類(lèi)型肌肉中存在差異表達(dá),但其在肌肉發(fā)育中的具體調(diào)控機(jī)制仍舊不明確。為驗(yàn)證SUFU在肌肉發(fā)育中的作用,我們檢測(cè)了SUFU在不同組織中的表達(dá)以及肌細(xì)胞增殖和分化中的時(shí)序分析,利用RNA干擾技術(shù)探索其對(duì)于肌細(xì)胞增殖分化中的作用。生物信息分析顯示,SUFU的3’UTR區(qū)域存在miR-423-5p的結(jié)合位點(diǎn)。作為調(diào)控SUFU的靶定mi RNA,miR-423-5p在肌肉中的作用機(jī)制并未深入了解。為了研究mi R-423-5p在成肌細(xì)胞增殖分化中的調(diào)控機(jī)制,我們首先利用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行了表達(dá)譜檢測(cè)以及增殖和分化過(guò)程中的表達(dá)時(shí)序分析,接著利用Agomir進(jìn)行超表達(dá)處理,研究mi R-423-5p在成肌細(xì)胞增殖和分化中的作用,進(jìn)一步完善miR-423-5p在肌肉發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制。上述研究獲得以下主要結(jié)果:1.在趾長(zhǎng)伸肌(EDL)和比目魚(yú)肌(Sol)文庫(kù)中分別獲得89658562和46723568條原始序列,通過(guò)比對(duì)分析鑒定出16415和16017個(gè)參考基因。2.EDL和Sol文庫(kù)中篩選出2152個(gè)差異表達(dá)基因,其中1534個(gè)上調(diào)以及618個(gè)下調(diào);在EDL和Sol組中的細(xì)胞功能、分子組分以及生物學(xué)過(guò)程中共有1442、1481和1526個(gè)基因比對(duì)到一個(gè)或多個(gè)GO條目中。3.在不同肌肉組織中的差異表達(dá)基因總共富集到241條信號(hào)通路,分別有230和216條通路受到上調(diào)和下調(diào)的影響。RNA-seq測(cè)序結(jié)果中選取了57個(gè)肌肉相關(guān)基因進(jìn)行分析,其中22個(gè)基因的表達(dá)水平差異并不顯著。篩選了其中18個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,發(fā)現(xiàn)其調(diào)控的靶位點(diǎn)大部分存在表達(dá)量的上下調(diào)差異;在EDL組中3271個(gè)轉(zhuǎn)錄本在5’端優(yōu)化,1559個(gè)轉(zhuǎn)錄本在3’端優(yōu)化;在Sol組中,2814個(gè)轉(zhuǎn)錄本在5’端優(yōu)化,1385個(gè)轉(zhuǎn)錄本在3’端優(yōu)化;EDL組和Sol組分析中分別發(fā)現(xiàn)了10962和9686個(gè)新轉(zhuǎn)錄本,9334和8585個(gè)可變剪切事件,以及58362和58395個(gè)潛在的SNP位點(diǎn)。4.SUFU在小鼠不同組織中廣泛表達(dá),其中在EDL和Sol組織中存在差異且與測(cè)序所得數(shù)據(jù)相符;SUFU在成肌細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程中,均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì);干擾SUFU能夠抑制C2C12成肌細(xì)胞的增殖和分化。5.mi R-423-5p作為SUFU的潛在靶定mi RNA,在小鼠的不同組織中廣泛表達(dá);在C2C12細(xì)胞增殖過(guò)程中,miR-423-5p的表達(dá)量前期上升至頂峰,之后逐漸降低至平穩(wěn)表達(dá)。超表達(dá)mi R-423-5p能夠抑制肌細(xì)胞增殖,并抑制細(xì)胞的分裂水平。6.mi R-423-5p的表達(dá)量隨著C2C12細(xì)胞分化逐漸上升,在分化的后期時(shí)達(dá)到頂峰,然后逐漸下降;超表達(dá)miR-423-5p能夠抑制C2C12細(xì)胞分化,并且抑制肌管形成。綜上,本研究獲得了高質(zhì)量的豬不同類(lèi)型肌肉組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),鑒定并研究了差異表達(dá)基因SUFU及其靶定的miR-423-5p,為肌肉發(fā)育和肌纖維類(lèi)型的調(diào)控機(jī)制提供了更加深入的認(rèn)識(shí)。
【關(guān)鍵詞】：豬 肌纖維類(lèi)型 高通量測(cè)序 差異基因 miRNA
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.2
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-26
• 1.1 骨骼肌研究進(jìn)展14-18
• 1.1.1 骨骼肌發(fā)育14-16
• 1.1.2 肌纖維類(lèi)型16-18
• 1.1.3 肌纖維類(lèi)型與肉質(zhì)18
• 1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究進(jìn)展18-21
• 1.2.1 RNA-seq原理19
• 1.2.2 RNA-seq測(cè)序平臺(tái)19-20
• 1.2.3 RNA-seq的生物信息學(xué)分析20-21
• 1.2.4 RNA-seq在豬育種中的應(yīng)用21
• 1.3 miRNA研究進(jìn)展21-24
• 1.3.1 miRNA的生成22
• 1.3.2 miRNA作用機(jī)制22-23
• 1.3.3 miRNA在骨骼肌發(fā)育中的作用23-24
• 1.3.4 miRNA在肌纖維類(lèi)型中的作用24
• 1.4 本研究的目的和意義24-26
• 第二章 豬不同肌纖維轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序26-34
• 2.1 材料及方法26-28
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集26
• 2.1.2 儀器和設(shè)備26
• 2.1.3 試劑26
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)方法26-28
• 2.2 結(jié)果與分析28-32
• 2.2.1 測(cè)序質(zhì)量評(píng)估28-30
• 2.2.2 參考序列比對(duì)30-32
• 2.3 討論32-33
• 2.4 小結(jié)33-34
• 第三章 豬不同肌肉組織文庫(kù)差異基因篩選及注釋34-41
• 3.1 材料與方法34-36
• 3.1.1 基因比對(duì)分析34
• 3.1.2 差異基因篩選與注釋34-35
• 3.1.3 基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化35
• 3.1.4 新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)和注釋35
• 3.1.5 可變剪切35
• 3.1.6 SNP分析35-36
• 3.2 結(jié)果與分析36-39
• 3.2.1 基因比對(duì)統(tǒng)計(jì)36
• 3.2.2 差異基因篩選36-37
• 3.2.3 基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化37
• 3.2.4 新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)和注釋37
• 3.2.5 可變剪切分析37-38
• 3.2.6 SNP分析38-39
• 3.3 討論39-40
• 3.4 小結(jié)40-41
• 第四章 豬不同肌肉組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)深度挖掘41-53
• 4.1 材料與方法41-42
• 4.1.1 GO功能顯著性富集分析41-42
• 4.1.2 Pathway顯著性富集分析42
• 4.1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建42
• 4.2 結(jié)果與分析42-51
• 4.2.1 豬不同類(lèi)型肌肉組織的GO功能分析42-43
• 4.2.2 不同肌肉組織中的差異基因通路分析43-44
• 4.2.3 肌肉相關(guān)基因的鑒定和篩選44-46
• 4.2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建46-47
• 4.2.5 豬不同肌肉組織差異基因在肌纖維相關(guān)的Pathway分析47-51
• 4.3 討論51
• 4.4 小結(jié)51-53
• 第五章 基因SUFU在成肌細(xì)胞增殖分化中的作用53-59
• 5.1 材料和方法53-54
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞53
• 5.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑53
• 5.1.3 小鼠組織樣品采集53
• 5.1.4 C2C12成肌細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染53-54
• 5.1.5 組織或細(xì)胞總RNA提取54
• 5.1.6 RT-qPCR檢測(cè)SUFU及相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)54
• 5.1.7 數(shù)據(jù)分析54
• 5.2 結(jié)果與分析54-57
• 5.2.1 SUFU基因在小鼠中的組織表達(dá)譜54-55
• 5.2.2 SUFU基因在成肌細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中的時(shí)序表達(dá)55
• 5.2.3 SUFU基因的siRNA干擾效率檢測(cè)55-56
• 5.2.4 干擾SUFU對(duì)成肌細(xì)胞增殖的作用56
• 5.2.5 干擾SUFU對(duì)成肌細(xì)胞分化的作用56-57
• 5.3 討論57-58
• 5.4 小結(jié)58-59
• 第六章 過(guò)表達(dá)miR4235P抑制C2C12成肌細(xì)胞增殖59-66
• 6.1 材料與方法59-61
• 6.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器59
• 6.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞59
• 6.1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染59-60
• 6.1.4 細(xì)胞總RNA提取60
• 6.1.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)60
• 6.1.6 蛋白免疫印記60
• 6.1.7 EdU檢測(cè)60
• 6.1.8 流式細(xì)胞分析60
• 6.1.9 CCK-8 檢測(cè)60-61
• 6.1.10 數(shù)據(jù)分析61
• 6.2 結(jié)果與分析61-64
• 6.2.1 mi R4235p的組織表達(dá)譜61
• 6.2.2 mi R4235p在C2C12成肌細(xì)胞增殖中的時(shí)序表達(dá)61-62
• 6.2.3 轉(zhuǎn)染miR4235p的Agomir后超表達(dá)效率檢測(cè)62
• 6.2.4 過(guò)表達(dá)miR4235p抑制細(xì)胞周期基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平62-63
• 6.2.5 過(guò)表達(dá)miR4235p抑制細(xì)胞增殖63-64
• 6.3 討論64-65
• 6.4 小結(jié)65-66
• 第七章 過(guò)表達(dá)miR4235P抑制C2C12成肌細(xì)胞分化66-72
• 7.1 材料與方法66-67
• 7.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器66
• 7.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染66
• 7.1.3 實(shí)時(shí)定量PCR66
• 7.1.4 蛋白免疫印記66
• 7.1.5 免疫熒光檢測(cè)肌管形成66-67
• 7.1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析67
• 7.2 結(jié)果與分析67-70
• 7.2.1 mi R4235p在C2C12成肌細(xì)胞分化中的時(shí)序表達(dá)67
• 7.2.2 轉(zhuǎn)染miR4235p后超表達(dá)效率檢測(cè)67-68
• 7.2.3 超表達(dá)miR4235p抑制成肌分化標(biāo)志基因的mRNA和蛋白表達(dá)68-69
• 7.2.4 超表達(dá)miR4235p抑制肌管的形成69-70
• 7.3 討論70-71
• 7.4 小結(jié)71-72
• 結(jié)論72-73
• 創(chuàng)新點(diǎn)73-74
• 進(jìn)一步研究?jī)?nèi)容74-75
• 參考文獻(xiàn)75-81
• 附錄81-89
• 致謝89-90
• 作者簡(jiǎn)介90

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  本文關(guān)鍵詞：豬肌纖維類(lèi)型關(guān)鍵基因篩選及miR-423-5p的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：354766