本文關(guān)鍵詞：豬DC-SIGN真核表達(dá)載體構(gòu)建及介導(dǎo)PEDV感染作用的初步驗(yàn)證，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以腹瀉、嘔吐、脫水為主要特征的一種腸道傳染病,對(duì)哺乳仔豬致死率可達(dá)100%。自2010年末開(kāi)始,PED在我國(guó)大部分省市和地區(qū)出現(xiàn)了爆發(fā),給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此,開(kāi)展PEDV感染機(jī)制相關(guān)的基礎(chǔ)研究具有現(xiàn)實(shí)意義和緊迫性。C型凝集素DC-SIGN是樹(shù)突狀細(xì)胞表面特異性表達(dá)的一種多功能蛋白分子,在PEDV同屬的SARS冠狀病毒(SARS-CoV)、貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)、禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)和人冠狀病毒229E(HCoV-229E)感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。由此可見(jiàn),豬DC-SIGN在PEDV感染中作用的探索研究,能為PEDV感染機(jī)理的解析提供基礎(chǔ)信息。為了獲得豬DC-SIGN單因子血清,本研究根據(jù)Genbank發(fā)表的人DC-SIGN核苷酸序列(EU684956),按照大腸桿菌密碼子偏愛(ài)性,人工合成了豬DC-SIGN基因(pDC-SIGN),并在5'端和3'端分別引入BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)。pDC-SIGN基因克隆至原核表達(dá)載體pGEX-6p-1后,在大腸桿菌E.coli BL21中獲得了成功表達(dá)。利用純化的pDC-SIGN重組蛋白免疫BALB/c鼠,制備了pDC-SIGN重組蛋白單因子血清。Western blot結(jié)果顯示,pDC-SIGN重組蛋白單因子血清能夠識(shí)別豬小腸黏膜上皮細(xì)胞(IEC)、豬睪丸細(xì)胞(ST)、豬腎細(xì)胞(PK15)和仔豬小腸組織中天然的豬DC-SIGN,可用于后續(xù)pDC-SIGN的檢測(cè)。為了構(gòu)建pDC-SIGN真核表達(dá)載體,本研究根據(jù)真核宿主細(xì)胞密碼子的偏愛(ài)性,人工合成了pDC-SIGN基因(pSIGN),并在5'端和3'端分別引入EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)。免疫熒光試驗(yàn)和Western blot試驗(yàn)證明,合成的pSIGN基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PEDV非敏感細(xì)胞中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)后,獲得了成功表達(dá)。病毒感染細(xì)胞計(jì)數(shù)試驗(yàn)顯示,表達(dá)pSIGN的CHO細(xì)胞,在PEDV感染后12h、24h、36h和48h,感染細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組(p0.05)。本研究制備了pDC-SIGN單因子血清,構(gòu)建了pDC-SIGN真核表達(dá)載體,初步驗(yàn)證pDC-SIGN在CHO細(xì)胞中過(guò)表達(dá)能增加PEDV感染的細(xì)胞數(shù),為pDC-SIGN在PEDV感染中作用深入的研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：PEDV 豬DC-SIGN 單因子血清 過(guò)表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S858.28
【目錄】：

• 摘要4-5
• abstract5-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-20
• 1.1 PEDV概述10-11
• 1.1.1 PEDV基因組結(jié)構(gòu)10
• 1.1.2 PEDV結(jié)構(gòu)蛋白功能10-11
• 1.1.3 PEDV分子流行病學(xué)11
• 1.2 PEDV受體及感染相關(guān)蛋白研究進(jìn)展11-14
• 1.2.1 豬氨基肽酶N作為豬冠狀病毒細(xì)胞受體研究進(jìn)展12-13
• 1.2.2 PEDV其他感染相關(guān)蛋白研究進(jìn)展13-14
• 1.3 DC-SIGN在冠狀病毒感染中的作用14-18
• 1.3.1 DC-SIGN的結(jié)構(gòu)與表達(dá)14-16
• 1.3.2 DC-SIGN在冠狀病毒感染中作用研究進(jìn)展16-18
• 1.4 本研究目的意義18-20
• 第二章 豬DC-SIGN基因原核表達(dá)及其單因子血清的制備20-32
• 2.1 材料20-21
• 2.1.1 質(zhì)粒、載體及菌種20
• 2.1.2 主要生化試劑及試驗(yàn)動(dòng)物20
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備20-21
• 2.2 方法21-27
• 2.2.1 pDC-SIGN基因的合成21
• 2.2.2 pDC-SIGN基因鑒定引物的設(shè)計(jì)21-22
• 2.2.3 pDC-SIGN基因原核表達(dá)與純化22-25
• 2.2.4 重組蛋白pDC-SIGN的Western blot分析25-26
• 2.2.5 重組蛋白pDC-SIGN單因子血清的制備26-27
• 2.2.6 重組蛋白pDC-SIGN單因子血清的鑒定27
• 2.3 結(jié)果27-31
• 2.3.1 pDC-SIGN基因表達(dá)與純化27-30
• 2.3.2 重組蛋白pDC-SIGN的Western blot分析30
• 2.3.3 重組蛋白pDC-SIGN單因子血清Western blot分析30-31
• 2.4 討論31
• 2.5 小結(jié)31-32
• 第三章 豬DC-SIGN基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及介導(dǎo)PEDV感染作用的初步驗(yàn)證32-52
• 3.1 材料32-33
• 3.1.1 質(zhì)粒、病毒和細(xì)胞32
• 3.1.2 主要生化試劑32
• 3.1.3 儀器設(shè)備32-33
• 3.2 方法33-37
• 3.2.1 豬DC-SIGN真核表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定33-34
• 3.2.2 重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞系及鑒定34-36
• 3.2.3 重組質(zhì)粒介導(dǎo)PEDV入侵CHO細(xì)胞的初步研究36-37
• 3.3 結(jié)果37-50
• 3.3.1 重組真核表達(dá)質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果37
• 3.3.2 重組真核表達(dá)質(zhì)粒免疫熒光鑒定結(jié)果37-38
• 3.3.3 重組真核表達(dá)質(zhì)粒Western blot鑒定38-39
• 3.3.4 PEDV感染表達(dá)pDC-SIGN CHO細(xì)胞 12 h結(jié)果39-41
• 3.3.5 PEDV感染表達(dá)pDC-SIGN CHO細(xì)胞 24h結(jié)果41-43
• 3.3.6 PEDV感染表達(dá)pDC-SIGN CHO細(xì)胞 36 h結(jié)果43-45
• 3.3.7 PEDV感染表達(dá)pDC-SIGN CHO細(xì)胞 48 h結(jié)果45-47
• 3.3.8 PEDV感染表達(dá)pDC-SIGN CHO細(xì)胞 60 h結(jié)果47-50
• 3.3.9 數(shù)據(jù)分析50
• 3.4 討論50-51
• 3.5 小結(jié)51-52
• 第四章 全文結(jié)論52-54
• 參考文獻(xiàn)54-60
• 附錄60-64
• 致謝64-66
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷66-67

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本文編號(hào)：354733