本文關(guān)鍵詞：PI3K-Akt通路對ORFV復(fù)制及其感染宿主細(xì)胞凋亡過程的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：羊傳染性膿皰病毒(Orf virus,ORFV)為痘病毒科(Poxviridae)脊索亞科(Chordopoxvirinae)副痘病毒屬(Parapoxvirus)代表性成員之一,是一種重要的人獸共患病病原,能夠感染引起綿羊、山羊等反芻動物以及人的一種急性、高度接觸性傳染病,臨床上以在感染動物口唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水皰、膿皰和疣狀厚痂為主要特征。近年來,Orf在世界各地羊群中頻繁暴發(fā)流行,我國甘肅、新疆、內(nèi)蒙、吉林等一些主要養(yǎng)羊省區(qū)羊群中也不斷有該病暴發(fā)流行的報道。ORFV自身所具有的免疫逃避特性以及缺乏有效防控措施很可能是導(dǎo)致該病在羊群中暴發(fā)流行增多的重要原因。目前,由于存在對其介導(dǎo)的宿主免疫和致病機制研究深度不夠等問題,導(dǎo)致用于羊傳染性膿皰病防治的新疫苗和新藥物的開發(fā)研制仍面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。鑒于上述情況,加強對ORFV的基礎(chǔ)研究(基因、蛋白、作用機制等)十分必要,尤其是對ORFV致病分子機制的研究。為了全面解析ORFV致病分子機制,本課題組前期從病毒與宿主互作角度出發(fā),利用Illumina/Solexa高通量測序技術(shù)成功構(gòu)建了ORFV感染前后宿主細(xì)胞m RNA差異表達(dá)譜,經(jīng)Gene Ontology分析篩選出多條差異表達(dá)基因,其中磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol kinase 3-kinase,PI3K)在感染后48 h和96 h呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)。PI3K是一種重要的胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶,主要參與PI3K-Akt等經(jīng)典信號通路,在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、分化和凋亡等方面具有重要作用,多種病毒都通過對宿主細(xì)胞PI3K-Akt信號通路的調(diào)控而實現(xiàn)對宿主細(xì)胞的感染。然而,目前尚不清楚ORFV感染是否能夠激活宿主細(xì)胞中的PI3K-Akt信號通路,同時對PI3K-Akt信號通路在ORFV感染過程中的作用,以及其對ORFV感染宿主細(xì)胞凋亡影響也知之甚少。本研究首先利用熒光定量PCR、Western blotting方法分別從基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平對感染不同時間段(3、6、12、24、48、72 h)PI3K的表達(dá)變化規(guī)律進(jìn)行分析,與未接毒細(xì)胞相比,PI3K在感染后不同時間段均呈上升趨勢,且隨著感染時間延長而增加,該結(jié)果與前期構(gòu)建的m RNA表達(dá)譜分析結(jié)果相一致。接下來我們對ORFV感染是否能夠激活宿主細(xì)胞中的PI3K-Akt信號通路進(jìn)行探討,使用能夠特異性識別磷酸化Akt的抗體(p-S473)進(jìn)行Western blotting檢測發(fā)現(xiàn),磷酸化Akt水平在3 hpi(hours post-infection)出現(xiàn)顯著升高,直至48 hpi仍能檢測到較高水平的磷酸化Akt,上述結(jié)果表明ORFV感染Hela細(xì)胞過程中PI3K-Akt信號通路被活化。為進(jìn)一步明確PI3K-Akt信號途徑對ORFV侵染復(fù)制的影響,利用PI3K特異性抑制劑LY294002對PI3K進(jìn)行抑制處理后接種ORFV,收集感染后不同時間段(12、24、48、72 h)細(xì)胞進(jìn)行定量PCR檢測和TCID50測定,結(jié)果顯示,加入LY294002處理后,其病毒滴度低于接毒后未處理細(xì)胞組,由此可見阻斷該通路對ORFV的入侵具有抑制作用。上述研究結(jié)果表明,PI3K-Akt通路對ORFV在宿主細(xì)胞中的復(fù)制增殖具有明顯的促進(jìn)作用。由于PI3K-Akt信號通路在調(diào)控細(xì)胞凋亡過程中也發(fā)揮著重要作用,因此本研究進(jìn)一步探討了ORFV感染過程中PI3K-Akt信號通路對宿主細(xì)胞凋亡的影響。利用LY294002阻斷PI3K-Akt信號通路后,經(jīng)免疫熒光觀察、流式檢測發(fā)現(xiàn)ORFV感染Hela細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象,該結(jié)果表明PI3K-Akt信號通路能夠抑制ORFV誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步明確PI3K-Akt信號通路抑制ORFV誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡的途徑,本研究利用Western blotting等方法對PI3K-Akt通路下游關(guān)鍵分子蛋白GSK-3β、MDM2和Bad的變化情況進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,與ORFV正常感染Hela細(xì)胞相比,使用LY294002抑制劑的ORFV感染Hela細(xì)胞,在感染后6 h和24 h細(xì)胞中Bad/β-actin比值發(fā)生顯著變化,而MDM2/β-actin和GSK-3β/β-actin比值都未見明顯變化。上述結(jié)果表明,PI3K-Akt信號通路可能通過下游的Bad分子抑制ORFV感染Hela細(xì)胞過程中凋亡現(xiàn)象的發(fā)生。上述研究結(jié)果顯示,PI3K-Akt信號通路對ORFV在Hela細(xì)胞的復(fù)制增殖具有明顯的促進(jìn)作用,并可能通過下游的Bad途徑來抑制ORFV感染Hela細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生而有益于ORFV的復(fù)制增殖。該研究結(jié)果不僅有利于深入理解ORFV的感染及致病機制,而且對針對該病的預(yù)防和治療具有重要意義。
【關(guān)鍵詞】：PI3K-Akt通路 羊傳染性膿皰病毒 LY294002 復(fù)制 細(xì)胞凋亡 Bad
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文縮寫詞表11-13
• 前言13-15
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述15-30
• 第一章 羊傳染性膿皰病的研究進(jìn)展15-24
• 1.1 流行病學(xué)特點15-16
• 1.2 病原學(xué)研究16-19
• 1.3 作為病毒載體的應(yīng)用19
• 1.4 致病機制研究19-21
• 1.5 診斷與防治21-24
• 第二章 PI3K-Akt信號通路的研究24-30
• 2.1 PI3K-Akt信號通路概述24-25
• 2.2 PI3K-Akt信號通路的分子生物學(xué)功能25-27
• 2.3 PI3K-Akt信號通路在病毒感染過程中的研究27-28
• 2.4 PI3K-Akt信號通路的抗凋亡作用28
• 2.5 小結(jié)28-30
• 第二篇 研究內(nèi)容30-74
• 第一章 磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）在ORFV感染過程中變化規(guī)律研究30-47
• 1.1 材料與方法30-39
• 1.2 結(jié)果39-44
• 1.3 討論44-46
• 1.4 小結(jié)46-47
• 第二章 PI3K-Akt信號通路對ORFV復(fù)制增殖的影響47-60
• 2.1 材料與方法48-52
• 2.2 結(jié)果52-57
• 2.3 討論57-59
• 2.4 小結(jié)59-60
• 第三章 PI3K-Akt信號通路對ORFV感染宿主細(xì)胞凋亡的影響60-74
• 3.1 材料與方法61-65
• 3.2 結(jié)果65-70
• 3.3 討論70-73
• 3.4 小結(jié)73-74
• 結(jié)論74-75
• 參考文獻(xiàn)75-90
• 導(dǎo)師簡介90-91
• 作者簡介91-92
• 致謝92

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：PI3K-Akt通路對ORFV復(fù)制及其感染宿主細(xì)胞凋亡過程的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：348040