本文關(guān)鍵詞：FHL2基因在雞骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖與分化中的作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：FHL2 (Four and a Half LIM protein 2)屬于FHL蛋白家族的成員,是一種只含有四個半LIM結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。已有研究表明,FHL2直接或間接參與調(diào)控衛(wèi)星細胞增值與分化相關(guān)重要通路(Wnt/β-catenin, TGFβ)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,且該基因在雞出生后不同階段的胸肌中表達呈現(xiàn)顯著差異,推測FHL2基因可能為調(diào)控雞骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖分化的重要因子。因此,本研究通過對體外培養(yǎng)的原代雞胸肌衛(wèi)星細胞進行FHL2 SiRNA的轉(zhuǎn)染處理,觀察對轉(zhuǎn)染不同時間點(12h、24h、48h和72h)的肌衛(wèi)星細胞增增與分化形態(tài),并通過RT-PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后(12h、24h和48h)相關(guān)成肌調(diào)節(jié)因子以及Wnt/β-catenin、TGFβ、Notch三條重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵基因的1mRNA表達,以及采用Western-Blot檢測了FHL2、MYH7B以及NUMB蛋白在轉(zhuǎn)染后(24h、48h和72h)的蛋白表達情況。結(jié)果表明：(1)細胞形態(tài)學(xué)變化：轉(zhuǎn)染后12h,三個試驗組細胞在形態(tài)學(xué)上沒有明顯的差異；24h后,處理組的衛(wèi)星細胞數(shù)量明顯少于兩個對照組,對照組細胞極少部分出現(xiàn)分化；48h后,兩個對照組細胞長滿且大量分化,而處理組細胞少量增殖且僅有極少數(shù)細胞開始分化；72h后,兩個對照組完全分化且出現(xiàn)肌管,而處理組的細胞數(shù)量無明顯變化,部分細胞開始分化,但無肌管出現(xiàn)。(2)成肌調(diào)節(jié)因子的mRNA表達：在轉(zhuǎn)染12h和24h后,處理組中FHL2的mRNA表達顯著低于兩個對照組(P0.05)；轉(zhuǎn)染后12h,處理組中成肌調(diào)節(jié)因子MyoD和MyoG的mRNA表達量顯著低于兩個對照組(P0.05)；轉(zhuǎn)染后24h,處理組中MyoG和MYHC的mRNA表達量顯著低于兩個對照組(P0.05)；三個試驗組中MRF4的表達量在轉(zhuǎn)染后的三個時間點均差異不顯著(P0.05)(3) Notch信號通路：轉(zhuǎn)染12h后,處理組中hairyl的1mRNA表達量顯著低于空白對照組和陰性對照組(P0.05)；轉(zhuǎn)染24h后,處理組中Notch2、Hey1以及hairy1的mRNA表達量顯著或極顯著低于對照組(P0.05或P0.01)；轉(zhuǎn)染48h后,處理組中NUMB的mRNA表達量極顯著低于另兩個組(P0.01)；(4)TGFβ信號通路：關(guān)鍵基因ACVR1的mRNA表達量在轉(zhuǎn)染12h時處理組顯著低于兩個對照組(P0.05); ACVR2的mRNA表達量則在轉(zhuǎn)染后三個時間點中均為處理組顯著低于兩個對照組(P0.05)；(5)Wnt/β-catenin信號通路：轉(zhuǎn)染12h后,處理組中β-catenin、Wnt2b以及Wnt4的mRNA表達量顯著或極顯著低于對照組(P0.05或P0.01)；轉(zhuǎn)染24h后,處理組中Wnt4和Wnt6的mRNA表達量極顯著低于對照組(P0.01)；轉(zhuǎn)染48h后,處理組中GSK3β和Wnt5α的mRNA表達量極顯著低于對照組(P0.01)。(6) Western-Blot檢測表明：轉(zhuǎn)染48h后,處理組中FHL2蛋白和MYH7B蛋白的表達量明顯低于空白對照組和陰性對照組；在轉(zhuǎn)染72h后,處理組中NUMB蛋白的表達量明顯低于兩個對照組。綜上,轉(zhuǎn)染FHL2 SiRNA后,雞骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖和分化均受到明顯的抑制,FHL2的表達量降低下調(diào)部分成肌因子的表達,Wnt/β-catenin、TGFβ、Notch三條通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也受到不同程度的抑制。因此,本研究推測FHL2基因可能通過Wnt/β-catenin、TGFβ、Notch三條通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來調(diào)控雞骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖和分化,從而影響雞肌肉的生長。
【關(guān)鍵詞】：雞 骨骼肌衛(wèi)星細胞 FHL2基因 增殖分化 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S831
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 英文縮寫詞(ABBREVIATIONS)10-13
• 1 文獻綜述13-27
• 1.1 衛(wèi)星細胞與骨骼肌發(fā)育13-24
• 1.1.1 骨骼肌發(fā)育過程13-15
• 1.1.2 骨骼肌衛(wèi)星細胞15-18
• 1.1.3 影響衛(wèi)星細胞增殖分化的相關(guān)基因和信號通路18-24
• 1.2 FHL2與肌衛(wèi)星細胞24-27
• 1.2.1 FHL2概述24-25
• 1.2.2 FHL2基因在骨骼肌發(fā)育和再生中的研究進展25-26
• 1.2.3 FHL2與肌衛(wèi)星細胞增殖分化調(diào)控26-27
• 1.3 本試驗的目的與意義27
• 2 材料與方法27-44
• 2.1 試驗材料27-28
• 2.2 試驗試劑與耗材28-30
• 2.2.1 熒光標(biāo)記SIRNA28
• 2.2.2 主要試劑及試劑盒28-29
• 2.2.3 常用試劑的配制29
• 2.2.4 主要儀器設(shè)備29-30
• 2.2.5 主要應(yīng)用的生物學(xué)軟件30
• 2.3 試驗方法30-44
• 2.3.1 CDNA模板的制備30-32
• 2.3.2 FHL2基因CDS區(qū)的獲得以及不同組織中的表達情況分析32-35
• 2.3.3 細胞試驗35-38
• 2.3.4 轉(zhuǎn)染細胞熒光定量PCR38-40
• 2.3.5 轉(zhuǎn)染細胞蛋白WESTERN BLOT40-44
• 2.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析44
• 3 結(jié)果與分析44-61
• 3.1 FHL2基因CDS區(qū)序列與不同組織中的表達情況44-47
• 3.1.1 FHL2基因CDS區(qū)序列44-45
• 3.1.2 FHL2基因在各組織中的表達45-47
• 3.2 雞原代骨骼肌衛(wèi)星細胞(SMSCS)形態(tài)學(xué)觀察47-48
• 3.3 FHL2轉(zhuǎn)染SIRNA位點的選取48-49
• 3.4 干擾FHL2對雞骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖分化的影響49-52
• 3.5 干擾FHL2對調(diào)控骨骼肌衛(wèi)星細胞發(fā)育相關(guān)成肌調(diào)節(jié)因子及通路關(guān)鍵基因表達量的影響52-58
• 3.5.1 細胞轉(zhuǎn)染后不同時間點FHL2基因表達量的變化52
• 3.5.2 干擾FHL2對衛(wèi)星細胞中成肌調(diào)節(jié)因子的影響52-54
• 3.5.3 干擾FHL2對衛(wèi)星細胞相關(guān)信號通路關(guān)鍵基因的影響54-58
• 3.6 干擾FHL2對部分衛(wèi)星細胞分化相關(guān)基因蛋白表達量的影響58-61
• 4 討論61-64
• 4.1 FHL2基因?qū)﹄u衛(wèi)星細胞增殖與分化的影響61-63
• 4.1.1 FHL2基因在雞體內(nèi)各組織的表達61-62
• 4.1.2 FHL2基因?qū)πl(wèi)星細胞形態(tài)學(xué)的影響62
• 4.1.3 FHL2基因?qū)πl(wèi)星細胞增殖分化相關(guān)成肌調(diào)節(jié)因子的影響62-63
• 4.2 FHL2基因影響雞衛(wèi)星細胞增殖與分化的主要作用信號通路63-64
• 4.2.1 FHL2基因?qū)NT/B-CATENIN信號通路的調(diào)控63
• 4.2.2 FHL2基因?qū)GFB信號通路的調(diào)控63-64
• 4.2.3 FHL2基因?qū)OTCH信號通路的調(diào)控64
• 5 結(jié)論64-65
• 參考文獻65-71
• 致謝71-72
• 攻讀碩士研究生期間發(fā)表的論文和專利72

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