發(fā)布時間：2017-05-01 15:12

  本文關(guān)鍵詞：豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白E0基因打靶奶山羊的制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的一種流行范圍廣、高度接觸性的烈性傳染病,是威脅養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一。就現(xiàn)階段而言,我國并未完全掌握徹底消滅豬瘟的方法。我國控制豬瘟病毒主要是采用傳統(tǒng)疫苗。但由于豬瘟的流行形式發(fā)生了很大變化,已經(jīng)不能對豬瘟起到很好的保護(hù),因此,研究新型基因工程疫苗為大勢所趨。豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白E0(Classical swine fever virus,CSFV E0)可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,從而使機(jī)體產(chǎn)生免疫。編碼CSFV E0蛋白的核苷酸序列保守性相當(dāng)高,因此CSFV E0蛋白可當(dāng)成一種靶蛋白來防治豬瘟。本文利用TALEN基因打靶技術(shù)將含有豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白E0基因的打靶載體定點(diǎn)整合到山羊β-乳球蛋白第一外顯子中。在山羊乳腺上皮細(xì)胞中驗(yàn)證,其能夠誘導(dǎo)表達(dá)豬瘟E0結(jié)構(gòu)蛋白,這為以轉(zhuǎn)CSFV E0基因的克隆細(xì)胞為供核細(xì)胞,進(jìn)行核移植和胚胎移植來制備高效表達(dá)豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因E0的山羊乳腺生物反應(yīng)器奠定了基礎(chǔ)。研究內(nèi)容如下:1.CSFV E0基因在乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的針對山羊β-乳球蛋白基因第一外顯子的TALENs表達(dá)載體和包含CSFV E0基因的打靶載體共轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細(xì)胞,用藥物(G418)進(jìn)行篩選獲得單克隆,并對獲得的克隆進(jìn)行5'端和3'端鑒定,鑒定都為陽性的克隆進(jìn)行激素誘導(dǎo)24小時后,收集培養(yǎng)液和細(xì)胞。定量PCR和Western blot技術(shù)檢測證明,轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞能夠表達(dá)并分泌出CSFV E0蛋白。2.制備含有CSFV E0基因的打靶奶山羊應(yīng)用電轉(zhuǎn)染的方法將實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的針對山羊β-乳球蛋白基因第一外顯子的TALENs表達(dá)載體和含有CSFV E0基因的打靶載體共轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞,用藥物(G418)進(jìn)行篩選獲得單克隆,并通過5'端和3'端PCR的檢測,鑒定豬瘟結(jié)構(gòu)蛋白E0基因定點(diǎn)整合到山羊β-乳球蛋白基因中的預(yù)期位點(diǎn),并選取形態(tài)良好的克隆細(xì)胞株,運(yùn)用體細(xì)胞核移植技術(shù)制備含有CSFV E0基因的克隆胚胎,共構(gòu)建了138枚克隆胚胎,移植6只受體山羊,每只20-25枚克隆胚胎,并獲得轉(zhuǎn)基因山羊一只,經(jīng)5'端和3'端PCR的檢測,是含有CSFV E0基因的打靶山羊。綜上所述,本文利用TALENs編輯技術(shù)使CSFV E0基因定點(diǎn)整合到山羊β-乳球蛋白第一外顯子內(nèi),并結(jié)合體細(xì)胞移植和胚胎移植技術(shù)制備含有CSFV E0基因的乳腺生物反應(yīng)器,使山羊乳腺分泌表達(dá)CSFV E0蛋白,為制備CSFV E0基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白E0 TALEN基因打靶技術(shù) 山羊乳腺上皮細(xì)胞 胎兒成纖維細(xì)胞 乳腺生物反應(yīng)器
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.651;Q78
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-24
• 1.1 豬瘟12-19
• 1.1.1 豬瘟的概述12-17
• 1.1.2 豬瘟的防控措施17-19
• 1.2 乳腺生物反應(yīng)器19-20
• 1.2.1 乳腺生物反應(yīng)器的概念19
• 1.2.2 乳腺生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展19-20
• 1.3 基因編輯技術(shù)20-24
• 1.3.1 鋅指核酸酶20-21
• 1.3.2 轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶21-22
• 1.3.3 RNA介導(dǎo)的工程核酸酶22-24
• 第二章 利用TALEN介導(dǎo)豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白E0基因在乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)24-36
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料24-25
• 2.1.1 載體及菌株24-25
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法25-30
• 2.2.1 乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)25-26
• 2.2.2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與單克隆陽性細(xì)胞的篩選26
• 2.2.3 單克隆細(xì)胞中豬瘟E0（CSFV E0）基因整合位點(diǎn)的檢測26-27
• 2.2.4 豬瘟病毒E0(CSFV E0)基因表達(dá)的PCR檢測27-28
• 2.2.5 豬瘟病毒E0(CSFV E0)基因表達(dá)的定量PCR檢測28-29
• 2.2.6 豬瘟病毒E0(CSFV E0)蛋白分泌表達(dá)檢測29-30
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-34
• 2.3.1 山羊乳腺上皮細(xì)胞的分離純化30-31
• 2.3.2 外源基因整合位點(diǎn)的檢測31-32
• 2.3.3 PCR檢測豬瘟病毒EO基因32-33
• 2.3.4 豬瘟病毒E0基因表達(dá)水平的檢測33-34
• 2.4 討論34-35
• 2.5 小結(jié)35-36
• 第三章 轉(zhuǎn)豬瘟病毒E0基因打靶奶山羊的制備36-45
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料36
• 3.1.1 載體及細(xì)胞36
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑36
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法36-40
• 3.2.1 組織塊法培養(yǎng)山羊胎兒成纖維細(xì)胞及其凍存36-37
• 3.2.2 胎兒成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及克隆的篩選37-38
• 3.2.3 豬瘟E0基因在胎兒成纖維細(xì)胞中的整合檢測38
• 3.2.4 轉(zhuǎn)基因克隆胚的移植38-39
• 3.2.5 受體山羊的妊娠檢測39
• 3.2.6 轉(zhuǎn)基因小羊PCR鑒定39-40
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果40-43
• 3.3.1 山羊胎兒成纖維細(xì)胞的組織塊培養(yǎng)及克隆的形成40
• 3.3.2 豬瘟病毒E0基因在胎兒成纖維細(xì)胞中的PCR鑒定40-42
• 3.3.3 轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的移植及檢測42-43
• 3.3.4 轉(zhuǎn)基因小羊PCR鑒定43
• 3.4 討論43-44
• 3.5 小結(jié)44-45
• 全文結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-57
• 附錄57-58
• 致謝58-59
• 作者簡介59

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 ;A Novel RT-LAMP Assay for Rapid and Simple Detection of Classical Swine Fever Virus[J];Virologica Sinica;2010年01期

2 ;Development of Multiple ELISAs for the Detection of Antibodies against Classical Swine Fever Virus in Pig Sera[J];Virologica Sinica;2012年01期

3 ;[J];;年期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 史子學(xué);孫金福;郭煥成;涂長春;;CSFV感染后宿主凋亡相關(guān)基因表達(dá)變化的研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2008年學(xué)術(shù)年會暨第六屆全國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年

2 史子學(xué);孫金福;郭煥成;涂長春;;CSFV感染后宿主凋亡相關(guān)基因表達(dá)變化研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物傳染病學(xué)分會第三屆豬病防控學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年

3 李素;郝建偉;孫金福;郭煥成;郭昌明;孫博興;涂長春;;CSFV感染豬原代血管內(nèi)皮細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)組分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物傳染病學(xué)分會第四次豬病防控學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

4 唐青海;張彥明;郭抗抗;何雷;范麗;仝剛;代晨;;豬瘟病毒(CSFV)NS2蛋白抑制MG132誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會暨中國免疫學(xué)會獸醫(yī)免疫分會第八次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

5 周遠(yuǎn)成;王琴;范學(xué)政;徐璐;徐志文;郭萬柱;;豬瘟病毒急性感染對豬外周血淋巴細(xì)胞的影響[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2008年學(xué)術(shù)年會暨第六屆全國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年

6 謝金文;沈志強(qiáng);管宇;韓玲;任艷玲;曲光剛;;CSFV、PRRSV雙重RT-PCR檢測方法的建立及其應(yīng)用[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2009學(xué)術(shù)年會論文集（下冊）[C];2009年

7 謝金文;沈志強(qiáng);管宇;韓玲;任艷玲;曲光剛;;CSFV、PRRSV雙重RT-PCR檢測方法的建立及其應(yīng)用[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學(xué)術(shù)研討會論文集（下冊）[C];2009年

8 杜蘭榮;李云崗;孫圣福;張棟;陳靜;;PRRSV、CSFV和PCV多重PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物傳染病學(xué)分會第四次豬病防控學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

9 鄭仲華;胡永明;趙明秋;陳金頂;;CSFV強(qiáng)弱毒株RT-PCR快速鑒別檢測方法研究[A];2012年鄂粵微生物學(xué)學(xué)術(shù)年會——湖北省暨武漢微生物學(xué)會成立六十年慶祝大會論文集[C];2012年

10 劉俊;王琴;范學(xué)政;徐璐;湯波;陳蕾;黃偉;;豬瘟病毒急性感染后病毒載量的動態(tài)分布規(guī)律研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2008年學(xué)術(shù)年會暨第六屆全國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳佳寧;層粘連蛋白受體作為豬瘟病毒吸附受體的鑒定[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

2 史子學(xué);豬瘟病毒感染豬外周血白細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組變化的研究[D];吉林大學(xué);2009年

3 李素;豬瘟病毒感染血管內(nèi)皮細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)及細(xì)胞因子表達(dá)變化分析[D];吉林大學(xué);2011年

4 何雷;豬瘟病毒NS5A蛋白在病毒致病中作用的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2012年

5 郭抗抗;豬瘟病毒的shRNA干擾、強(qiáng)弱毒鑒別及基因工程疫苗研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

6 李丹;血紅蛋白β亞基對豬瘟病毒增殖的調(diào)控作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

7 陳鍇;豬瘟慢性感染對豬免疫功能影響的細(xì)胞與分子機(jī)制研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

8 牛偉;PRRSV和CSFV實(shí)時熒光定量PCR方法的建立及PRRSV M蛋白重組質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)免疫研究[D];吉林大學(xué);2012年

9 肖一紅;豬瘟DNA疫苗的免疫病理學(xué)和分子病理學(xué)評價[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2007年

10 余興龍;提高豬瘟DNA疫苗免疫保護(hù)的探索研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2000年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 何文瑞;細(xì)胞硫氧還蛋白2與豬瘟病毒E2蛋白的相互作用及其對豬瘟病毒復(fù)制的調(diào)控作用[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

2 陳玉燕;9種豬病病原體GeXP多重PCR檢測方法的研究[D];重慶理工大學(xué);2015年

3 李星;豬瘟口服疫苗保護(hù)劑篩選及免疫效果評價[D];上海海洋大學(xué);2015年

4 邵明豪;腺病毒介導(dǎo)的CSFV E0基因在奶山羊乳腺中的表達(dá)[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

5 李滿;CSFV強(qiáng)弱毒鑒別和PRRSV快速檢測的TaqMan熒光定量RT-PCR方法的建立及應(yīng)用[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

6 張仙;豬藍(lán)耳病、豬瘟、流行性乙型腦炎可視化共檢基因芯片的構(gòu)建及初步應(yīng)用[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

7 張?jiān)ｌ?2014年江西地區(qū)保育豬CSFV、PRRSV、PCV2和PRV的分子流行病學(xué)調(diào)查[D];江西農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

8 冀艷華;豬溫病毒結(jié)構(gòu)蛋白E0基因打靶奶山羊的制備[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

9 周遠(yuǎn)成;CSFV SM株感染對豬外周血白細(xì)胞的影響以及在豬體內(nèi)的分布[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

10 白雪;不同CSF免疫狀態(tài)下豬體PRRS免疫狀態(tài)及IFN-γ分泌細(xì)胞的變化特征的研究[D];吉林大學(xué);2012年

  本文關(guān)鍵詞：豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白E0基因打靶奶山羊的制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號：339160