本文關(guān)鍵詞：TALEN介導(dǎo)的轉(zhuǎn)人血清白蛋白（HSA）基因山羊克隆胚的制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人血清白蛋白(HSA)是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)之一,具有重要的生物醫(yī)藥價(jià)值。傳統(tǒng)的生產(chǎn)方式主要來源于血漿分離,但是具有傳播疾病和供應(yīng)不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。利用乳腺生物反應(yīng)器,使外源蛋白基因特異性的在乳腺中表達(dá),并通過乳汁分泌出來,已成為安全穩(wěn)定的生產(chǎn)稀缺蛋白的重要手段。由于TALEN介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)能夠?qū)⑼庠椿蚨c(diǎn)插入基因組中,相比于隨機(jī)整合具有諸多優(yōu)勢(shì),同時(shí)利用轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,通過體細(xì)胞核移植是當(dāng)前生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的常規(guī)手段�；诖�,我們開展了如下工作:1.使用本實(shí)驗(yàn)室保存的定點(diǎn)打靶在山羊基因組β-乳球蛋白第一外顯子的TALEN質(zhì)粒對(duì),構(gòu)建了相應(yīng)的具有雙標(biāo)記活性的HSA打靶載體pgB-HSA-puro(+);2.通過組織塊法進(jìn)行山羊乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng),使用角蛋白18的免疫熒光染色對(duì)乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定。隨后將打靶載體pgB-HSA-puro(+)、TALEN質(zhì)粒對(duì)共轉(zhuǎn)山羊乳腺上皮細(xì)胞,使用含有1 000 ng/mL puro的細(xì)胞培養(yǎng)液篩選到了陽(yáng)性克隆,并通過激素誘導(dǎo)在陽(yáng)性乳腺上皮細(xì)胞中驗(yàn)證了內(nèi)源性BLG啟動(dòng)子對(duì)HSA表達(dá)調(diào)控的有效性;3.通過含有1 000 ng/mL puro的細(xì)胞培養(yǎng)液將打靶載體pgB-HSA-puro(+)、TALEN質(zhì)粒對(duì)共轉(zhuǎn)山羊胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行篩選,獲得了胎兒成纖維細(xì)胞的陽(yáng)性克隆,以其作為供體細(xì)胞,利用體細(xì)胞核移植獲得了轉(zhuǎn)HSA的克隆囊胚。最終,成功的構(gòu)建定點(diǎn)打靶山羊β-乳球蛋白第一外顯子的HSA打靶載體pgB-HSA-puro(+);并篩選到了TALEN介導(dǎo)的轉(zhuǎn)HSA基因的山羊成纖維細(xì)胞克隆,克隆打靶效率可達(dá)11%;為相關(guān)轉(zhuǎn)基因研究提供了細(xì)胞新材料;通過體細(xì)胞核移植,獲得了克隆囊胚,囊胚發(fā)育率可達(dá)20.8%。本試驗(yàn)驗(yàn)證了利用山羊乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)HAS蛋白的可行性,為下一步轉(zhuǎn)HSA基因羊的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：人血清白蛋白 TALEN 乳腺上皮細(xì)胞 體細(xì)胞核移植 山羊
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S827
【目錄】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-12
• 文獻(xiàn)綜述12-26
• 第一章 人血清白蛋白的研究進(jìn)展12-17
• 1.1 概述12-13
• 1.2 HSA基因13
• 1.3 HAS蛋白13-15
• 1.4 HSA的代謝15
• 1.5 HSA的生物功能15
• 1.6 HSA在生物醫(yī)藥上的應(yīng)用15-16
• 1.7 展望16-17
• 第二章 TALEN介導(dǎo)的基因編輯17-26
• 2.1 概述17-18
• 2.2 基因編輯技術(shù)的發(fā)展18
• 2.3 TALEN技術(shù)18-20
• 2.3.1 TALE DNA識(shí)別編碼19
• 2.3.2 TALE的結(jié)構(gòu)19-20
• 2.3.3 TALENs20
• 2.3.4 TALEN體系結(jié)構(gòu)和組裝方法20
• 2.4 TALEN的應(yīng)用20-21
• 2.4.1 在動(dòng)物中的應(yīng)用21
• 2.4.2 研究基因功能21
• 2.4.3 應(yīng)用于大規(guī)模的基因組編輯21
• 2.5 影響TALEN效率的因素21-24
• 2.5.1 用于同源重組的供體DNA22
• 2.5.2 TALEN的傳遞22-23
• 2.5.3 TALEN的傳遞方法23
• 2.5.4 打靶位點(diǎn)的選擇23
• 2.5.5 突變的檢測(cè)23-24
• 2.5.6 核酸外切酶對(duì)NHEJ的加強(qiáng)24
• 2.6 TALEN轉(zhuǎn)錄因子的設(shè)計(jì)24-25
• 2.7 展望25-26
• 實(shí)驗(yàn)部分26-54
• 第三章 HSA乳腺打靶載體的構(gòu)建及功能驗(yàn)證26-45
• 3.1 材料26-27
• 3.1.1 組織26
• 3.1.2 菌株和質(zhì)粒26
• 3.1.3 主要試劑26-27
• 3.2 HSA打靶載體的構(gòu)建27-30
• 3.2.1 HSA基因的獲得27-29
• 3.2.2 p BA-HSA載體的構(gòu)建29-30
• 3.2.3 HSA打靶載體pg B-HSA-puro的構(gòu)建30
• 3.3 pg B-HSA-puro打靶載體的功能驗(yàn)證30-35
• 3.3.1 山羊乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)30
• 3.3.2 山羊乳腺上皮細(xì)胞的鑒定30-31
• 3.3.3 puro最佳篩選濃度的確定31
• 3.3.4 乳腺上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染31-32
• 3.3.5 乳腺上皮細(xì)胞的篩選32
• 3.3.6 乳腺上皮細(xì)胞單克隆的鑒定32-33
• 3.3.7 打靶細(xì)胞的誘導(dǎo)33
• 3.3.8 HAS m RNA水平表達(dá)的檢測(cè)33-34
• 3.3.9 HSA蛋白水平的檢測(cè)34
• 3.3.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析34-35
• 3.4 結(jié)果35-42
• 3.4.1 HSA打靶載體的構(gòu)建35-37
• 3.4.2 山羊乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)37
• 3.4.3 山羊乳腺上皮細(xì)胞的鑒定37-38
• 3.4.4 puro篩選濃度的確定38
• 3.4.5 乳腺上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和篩選38-39
• 3.4.6 乳腺上皮細(xì)胞單克隆的鑒定39-41
• 3.4.7 HSA m RNA水平表達(dá)的檢測(cè)41
• 3.4.8 HSA蛋白水平的檢測(cè)41-42
• 3.5 討論42-43
• 3.6 小結(jié)43-45
• 第四章 TALEN介導(dǎo)的轉(zhuǎn)HSA山羊重構(gòu)胚的獲得45-54
• 4.1 材料和試劑45-46
• 4.1.1 材料45
• 4.1.2 主要試劑及配制45-46
• 4.2 山羊胎兒成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)46
• 4.3 山羊胎兒成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染46-47
• 4.4 陽(yáng)性克隆的篩選和鑒定47
• 4.5 山羊卵母細(xì)胞的收集和體外成熟47
• 4.6 體細(xì)胞的核移植和胚胎培養(yǎng)47-48
• 4.6.1 供體細(xì)胞的準(zhǔn)備47
• 4.6.2 卵母細(xì)胞的去核和注核47
• 4.6.3 胚胎的激活和培養(yǎng)47-48
• 4.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析48
• 4.8 結(jié)果48-51
• 4.8.1 山羊胎兒成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)48
• 4.8.2 陽(yáng)性克隆的篩選和鑒定48-50
• 4.8.3 體細(xì)胞的核移植和胚胎培養(yǎng)50-51
• 4.9 討論51-53
• 4.12 小結(jié)53-54
• 全文總結(jié)54-55
• 參考文獻(xiàn)55-64
• 致謝64-65
• 作者簡(jiǎn)介65

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 常青;姜懷志;陳娟;楊永梅;;世界山羊選育的現(xiàn)狀及展望[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2011年08期

2 蔣克平;;山羊的特殊價(jià)值及開發(fā)利用[J];甘肅畜牧獸醫(yī);1993年05期

3 馬力,蔣國(guó)材,謝立珍,王金貴,陶開其;雅安山羊乳的成分及理化特性Ⅱ.主要物理性質(zhì)[J];四川畜牧獸醫(yī);2000年10期

4 竇全林,白文林;山羊乳生化遺傳標(biāo)記的研究進(jìn)展[J];西南民族學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2002年02期

5 許民強(qiáng);注射器抽吸治療奶山羊乳眼不通癥[J];中獸醫(yī)學(xué)雜志;2004年01期

6 楊琴;蔡雷江;孫宗奇;朱秋勁;;薩能奶山羊乳的營(yíng)養(yǎng)特性及酸羊奶產(chǎn)品開發(fā)[J];貴州農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年01期

7 張俊霞;張海;馮永淼;;呼和浩特地區(qū)薩能山羊乳氨基酸組分研究[J];畜牧與飼料科學(xué);2009年09期

8 陳白希;;山羊肺炎的X線，

本文編號(hào)：325762