本文關鍵詞：TALEN介導的轉人血清白蛋白（HSA）基因山羊克隆胚的制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人血清白蛋白(HSA)是血漿中含量最豐富的蛋白質之一,具有重要的生物醫(yī)藥價值。傳統(tǒng)的生產方式主要來源于血漿分離,但是具有傳播疾病和供應不穩(wěn)定的缺點。利用乳腺生物反應器,使外源蛋白基因特異性的在乳腺中表達,并通過乳汁分泌出來,已成為安全穩(wěn)定的生產稀缺蛋白的重要手段。由于TALEN介導的基因編輯技術能夠將外源基因定點插入基因組中,相比于隨機整合具有諸多優(yōu)勢,同時利用轉基因細胞,通過體細胞核移植是當前生產轉基因動物的常規(guī)手段�；诖�,我們開展了如下工作:1.使用本實驗室保存的定點打靶在山羊基因組β-乳球蛋白第一外顯子的TALEN質粒對,構建了相應的具有雙標記活性的HSA打靶載體pgB-HSA-puro(+);2.通過組織塊法進行山羊乳腺上皮細胞的原代培養(yǎng),使用角蛋白18的免疫熒光染色對乳腺上皮細胞進行鑒定。隨后將打靶載體pgB-HSA-puro(+)、TALEN質粒對共轉山羊乳腺上皮細胞,使用含有1 000 ng/mL puro的細胞培養(yǎng)液篩選到了陽性克隆,并通過激素誘導在陽性乳腺上皮細胞中驗證了內源性BLG啟動子對HSA表達調控的有效性;3.通過含有1 000 ng/mL puro的細胞培養(yǎng)液將打靶載體pgB-HSA-puro(+)、TALEN質粒對共轉山羊胎兒成纖維細胞進行篩選,獲得了胎兒成纖維細胞的陽性克隆,以其作為供體細胞,利用體細胞核移植獲得了轉HSA的克隆囊胚。最終,成功的構建定點打靶山羊β-乳球蛋白第一外顯子的HSA打靶載體pgB-HSA-puro(+);并篩選到了TALEN介導的轉HSA基因的山羊成纖維細胞克隆,克隆打靶效率可達11%;為相關轉基因研究提供了細胞新材料;通過體細胞核移植,獲得了克隆囊胚,囊胚發(fā)育率可達20.8%。本試驗驗證了利用山羊乳腺生物反應器生產HAS蛋白的可行性,為下一步轉HSA基因羊的生產奠定了基礎。
【關鍵詞】：人血清白蛋白 TALEN 乳腺上皮細胞 體細胞核移植 山羊
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S827
【目錄】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-12
• 文獻綜述12-26
• 第一章 人血清白蛋白的研究進展12-17
• 1.1 概述12-13
• 1.2 HSA基因13
• 1.3 HAS蛋白13-15
• 1.4 HSA的代謝15
• 1.5 HSA的生物功能15
• 1.6 HSA在生物醫(yī)藥上的應用15-16
• 1.7 展望16-17
• 第二章 TALEN介導的基因編輯17-26
• 2.1 概述17-18
• 2.2 基因編輯技術的發(fā)展18
• 2.3 TALEN技術18-20
• 2.3.1 TALE DNA識別編碼19
• 2.3.2 TALE的結構19-20
• 2.3.3 TALENs20
• 2.3.4 TALEN體系結構和組裝方法20
• 2.4 TALEN的應用20-21
• 2.4.1 在動物中的應用21
• 2.4.2 研究基因功能21
• 2.4.3 應用于大規(guī)模的基因組編輯21
• 2.5 影響TALEN效率的因素21-24
• 2.5.1 用于同源重組的供體DNA22
• 2.5.2 TALEN的傳遞22-23
• 2.5.3 TALEN的傳遞方法23
• 2.5.4 打靶位點的選擇23
• 2.5.5 突變的檢測23-24
• 2.5.6 核酸外切酶對NHEJ的加強24
• 2.6 TALEN轉錄因子的設計24-25
• 2.7 展望25-26
• 實驗部分26-54
• 第三章 HSA乳腺打靶載體的構建及功能驗證26-45
• 3.1 材料26-27
• 3.1.1 組織26
• 3.1.2 菌株和質粒26
• 3.1.3 主要試劑26-27
• 3.2 HSA打靶載體的構建27-30
• 3.2.1 HSA基因的獲得27-29
• 3.2.2 p BA-HSA載體的構建29-30
• 3.2.3 HSA打靶載體pg B-HSA-puro的構建30
• 3.3 pg B-HSA-puro打靶載體的功能驗證30-35
• 3.3.1 山羊乳腺上皮細胞的原代培養(yǎng)30
• 3.3.2 山羊乳腺上皮細胞的鑒定30-31
• 3.3.3 puro最佳篩選濃度的確定31
• 3.3.4 乳腺上皮細胞的轉染31-32
• 3.3.5 乳腺上皮細胞的篩選32
• 3.3.6 乳腺上皮細胞單克隆的鑒定32-33
• 3.3.7 打靶細胞的誘導33
• 3.3.8 HAS m RNA水平表達的檢測33-34
• 3.3.9 HSA蛋白水平的檢測34
• 3.3.10 數據統(tǒng)計與分析34-35
• 3.4 結果35-42
• 3.4.1 HSA打靶載體的構建35-37
• 3.4.2 山羊乳腺上皮細胞的原代培養(yǎng)37
• 3.4.3 山羊乳腺上皮細胞的鑒定37-38
• 3.4.4 puro篩選濃度的確定38
• 3.4.5 乳腺上皮細胞的轉染和篩選38-39
• 3.4.6 乳腺上皮細胞單克隆的鑒定39-41
• 3.4.7 HSA m RNA水平表達的檢測41
• 3.4.8 HSA蛋白水平的檢測41-42
• 3.5 討論42-43
• 3.6 小結43-45
• 第四章 TALEN介導的轉HSA山羊重構胚的獲得45-54
• 4.1 材料和試劑45-46
• 4.1.1 材料45
• 4.1.2 主要試劑及配制45-46
• 4.2 山羊胎兒成纖維細胞的原代培養(yǎng)46
• 4.3 山羊胎兒成纖維細胞的轉染46-47
• 4.4 陽性克隆的篩選和鑒定47
• 4.5 山羊卵母細胞的收集和體外成熟47
• 4.6 體細胞的核移植和胚胎培養(yǎng)47-48
• 4.6.1 供體細胞的準備47
• 4.6.2 卵母細胞的去核和注核47
• 4.6.3 胚胎的激活和培養(yǎng)47-48
• 4.7 數據統(tǒng)計與分析48
• 4.8 結果48-51
• 4.8.1 山羊胎兒成纖維細胞的原代培養(yǎng)48
• 4.8.2 陽性克隆的篩選和鑒定48-50
• 4.8.3 體細胞的核移植和胚胎培養(yǎng)50-51
• 4.9 討論51-53
• 4.12 小結53-54
• 全文總結54-55
• 參考文獻55-64
• 致謝64-65
• 作者簡介65

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