發(fā)布時(shí)間：2017-04-25 02:24

  本文關(guān)鍵詞：犬新孢子蟲速殖子microRNA的鑒定與分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：犬新孢子蟲(Neospora caninum,N.caninum)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的頂復(fù)門原蟲,呈世界性分布。犬新孢子蟲對(duì)牲畜的危害特別嚴(yán)重,它不僅能夠引起包括牛、羊、犬、馬、狐貍、白尾鹿等多種孕畜出現(xiàn)流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎和木乃伊胎等嚴(yán)重的繁殖障礙性疾病,并且能夠?qū)е聞倓偝錾挠仔筮\(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)紊亂,對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。micro RNA(mi RNA)是非編碼小RNA家族中十分重要的一類分子,由21-25個(gè)核苷酸構(gòu)成,不能編碼蛋白合成,通過誘導(dǎo)產(chǎn)生RNA干擾(RNA interference,RNAi)機(jī)制,從而發(fā)揮對(duì)多種基因表達(dá)的調(diào)控作用。目前的研究表明mi RNA不僅具有組織特異性,還呈現(xiàn)時(shí)序性表達(dá)。揭示了mi RNA在多種生命活動(dòng)的調(diào)控過程中擔(dān)當(dāng)著十分重要的角色。mi RNA目前已經(jīng)在多種動(dòng)植物中被發(fā)現(xiàn),在寄生蟲的多個(gè)物種中也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的mi RNA,然而對(duì)新孢子蟲mi RNA的相關(guān)研究至今尚無報(bào)道,通過對(duì)犬新孢子蟲mi RNA的種類及其表達(dá)情況的探究,將為新孢子蟲相關(guān)蛋白質(zhì)功能的研究提供有效工具。本研究選用犬新孢子蟲速殖子時(shí)期為研究對(duì)象,通過高通量測(cè)序Solexa技術(shù)構(gòu)建了速殖子時(shí)期的小RNA文庫(kù)并對(duì)其進(jìn)行分析。在拷貝數(shù)統(tǒng)計(jì)中,兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣本共得到了55180517個(gè)s RNAs,其中兩個(gè)樣本間共有的s RNAs為53160938個(gè),占總量的96.34%。對(duì)測(cè)序原始結(jié)果進(jìn)行初步分析,兩個(gè)樣本分別得到了28575212和34778655條高質(zhì)量序列(High-quality Reads),其中干凈序列(Clean Reads)分別有25678775和29501742條,各占測(cè)序總量的89.86%和84.43%。非冗余序列(Unique Reads)分別有1125933和954987條,各占測(cè)序總量的4.38%和3.24%。將得到的干凈序列與犬新孢子蟲已知的基因組進(jìn)行比對(duì)分析,兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)分別有5889027(22.93%)和13412613(45.46%)個(gè)Reads能夠成功匹配到N.caninum參考基因組上,其中分別有4622636(78.50%)和10510023(78.36%)個(gè)Reads為單位置比對(duì)(Unique mapped),而1266391(21.50%)和2902590(21.64%)個(gè)Reads為多位點(diǎn)匹配(Multiple mapped)。然后對(duì)比對(duì)到參考基因組上的所有Reads進(jìn)行分布情況統(tǒng)計(jì),結(jié)果顯示Reads主要分布在基因間區(qū),其次是分布在非編碼外顯子區(qū)、CDS和內(nèi)含子。在基因組定位分析結(jié)果顯示測(cè)序Reads廣泛分布于犬新孢子蟲的14條染色體上,其中Ia號(hào)染色體上分布最多,IV號(hào)染色體上最少,不同染色體間分布差異較大。對(duì)犬新孢子蟲的小RNA長(zhǎng)度進(jìn)行分析,結(jié)果顯示所預(yù)測(cè)的小RNA序列的長(zhǎng)度主要分布在18-30 nt之間,尤其集中在18-22 nt。通過高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)方法,本課題成功鑒定了10個(gè)分屬于不同家族的與其他物種同源的保守mi RNA和290個(gè)犬新孢子蟲特異性mi RNA,其中有66個(gè)mi RNA來源于兩條臂,剩余的mi RNA來源于一條臂。最后利用q RT-PCR技術(shù),以SYBR Green為熒光染料對(duì)其中13個(gè)mi RNA的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行PCR驗(yàn)證,熒光定量結(jié)果與Solexa測(cè)序結(jié)果基本保持一致,表明了高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的真實(shí)性和可靠性。本研究在高通量測(cè)序技術(shù)的基礎(chǔ)上結(jié)合生物信息學(xué)相關(guān)技術(shù)對(duì)犬新孢子蟲速殖子時(shí)期的mi RNA種類及其表達(dá)譜進(jìn)行了測(cè)定與分析,將為新孢子蟲基因調(diào)控機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：犬新孢子蟲 速殖子 Solexa測(cè)序 microRNA qRT-PCR
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.723
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文縮寫詞表10-11
• 引言11-13
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述13-29
• 第1章 新孢子蟲概述13-17
• 1.1 犬新孢子蟲生活史13-14
• 1.2 犬新孢子蟲對(duì)細(xì)胞的侵入機(jī)制14
• 1.3 宿主的免疫反應(yīng)研究14-15
• 1.4 結(jié)語(yǔ)15-17
• 第2章 非編碼小RNA及MICRORNA研究進(jìn)展17-29
• 2.1 非編碼小RNA與基因沉默17-19
• 2.2 miRNAs的生物發(fā)生和作用機(jī)制19-22
• 2.3 寄生蟲miRNA的研究現(xiàn)狀22-28
• 2.4 結(jié)語(yǔ)28-29
• 第二篇 研究?jī)?nèi)容29-79
• 第1章 犬新孢子蟲速殖子的體外培養(yǎng)與純化及小RNA文庫(kù)的構(gòu)建與測(cè)序29-47
• 1.1 材料29-31
• 1.2 方法31-37
• 1.3 結(jié)果37-44
• 1.4 討論44-46
• 1.5 小結(jié)46-47
• 第2章 犬新孢子蟲速殖子時(shí)期MIRNA的發(fā)現(xiàn)與鑒定47-79
• 2.1 材料47-48
• 2.2 方法48-52
• 2.3 結(jié)果52-76
• 2.4 討論76-78
• 2.5 小結(jié)78-79
• 結(jié)論79-80
• 參考文獻(xiàn)80-89
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文89-90
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介90-91
• 作者簡(jiǎn)介91-92
• 致謝92

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