本文關鍵詞：綿羊PHD2基因克隆、表達及變異分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本試驗以甘肅高山細毛羊、藏綿羊、灘羊、塔什庫爾干羊、哈薩克羊和湖羊共6個綿羊群體為研究對象,克隆測定藏綿羊PHD2基因CDS序列并對其進行生物信息學分析;采用實時熒光定量PCR技術檢測PHD2基因mRNA在綿羊十二指腸等13個組織中的相對表達量。運用PCR-SSCP技術分析6個綿羊群體中PHD2基因的遺傳多態(tài)性,以探討藏綿羊PHD2基因遺傳特異性,豐富藏綿羊高原低氧適應候選基因的研究基礎數(shù)據(jù)。主要研究結(jié)果及結(jié)論如下:(1)本試驗經(jīng)克隆測序獲得藏綿羊PHD2基因CDS序列,序列長2609bp,編碼358個氨基酸殘基;與Ensemble數(shù)據(jù)庫中綿羊序列比對發(fā)現(xiàn)2個SNPs,均為同義突變。蛋白分子式為C1691H2674N496O514S12,分子量為38561.5,理論等電點(PI)為8.64。該蛋白由線粒體合成,為親水性蛋白和穩(wěn)定蛋白。預測分析發(fā)現(xiàn)藏綿羊PHD2蛋白無信號肽剪切位點和跨膜螺旋結(jié)構(gòu),存在兩個低復雜度區(qū)域和三個結(jié)構(gòu)域。該蛋白翻譯后修飾的主要方式是磷酸化,在細胞內(nèi)主要行翻譯、氨基酸生物合成、中央中介代謝、調(diào)節(jié)功能、復制和轉(zhuǎn)錄和脂肪酸代謝作用,且以連接酶的形式在細胞內(nèi)發(fā)揮底物合成等酶生物學作用。蛋白二級結(jié)以無規(guī)卷曲為主,三級結(jié)構(gòu)主要由β折疊和無規(guī)卷曲纏繞折疊形成。(2)PHD2基因在綿羊各組織部位中均有表達,但其表達存在組織差異性。其中在十二指腸中表達量最高,大腦和脾臟中該基因中度表達,在其他組織中中度或微量表達。(3)綿羊PHD2基因多態(tài)性豐富、遺傳變異程度高。在內(nèi)含子6-外顯子7區(qū)發(fā)現(xiàn)5處核苷酸突變。6個綿羊群體PHD2基因檢測到AD、AB、BC、BD共4種基因型,由A、B、C、D四個等位基因調(diào)控。序列比對可知,等位基因A序列與GenBank中公布的綿羊PHD2基因原序列無差異;等位基因B序列相較于原序列,在105處插入堿基A;等位基因C序列較原序列,在105處插入堿基A,存在c.278 TC顛換,等位基因D序列較原序列,存在c.188TC顛換、c.286AG顛換和c.290CA顛換;因為擴增序列為內(nèi)含子序列,因此不造成氨基酸的改變。
【關鍵詞】：藏綿羊 PHD2基因 PCR-SSCP 克隆 基因表達
【學位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S826
【目錄】：

• 摘要4-5
• Summary5-9
• 第一章 文獻綜述9-22
• 1 高原低氧適應性進化9-15
• 1.1 生理生化、形態(tài)結(jié)構(gòu)和細胞代謝等的適應性進化特征9-10
• 1.2 分子水平適應進化10-15
• 2 脯氨酸羥化酶概述15-18
• 2.1 PHDs家族概述15-16
• 2.2 PHDs的類型和分布16
• 2.3 染色體定位及基因結(jié)構(gòu)16
• 2.4 PHDs家族的工作機制16-17
• 2.5 PHDs家族的生物學功能17-18
• 3 PHD2基因及其研究進展18-20
• 3.1 PHD2基因的結(jié)構(gòu)特點及表達調(diào)控18
• 3.2 PHD2基因多態(tài)性和表達研究18-20
• 3.3 PHD2基因在高原低氧適應中的研究進展20
• 4 本研究的目的和意義20-22
• 第二章 試驗材料與研究方法22-39
• 1 試驗材料22-26
• 1.1 血樣、組織樣采集22
• 1.2 主要試劑、儀器設備和主要溶劑配制22-26
• 2 試驗方法26-36
• 2.1 DNA的提取和檢測26-27
• 2.2 總RNA的提取和檢測27-29
• 2.3 cDNA合成29-30
• 2.4 引物設計與擴增30-32
• 2.5 擴增產(chǎn)物瓊脂糖檢測32-33
• 2.6 擴增產(chǎn)物SSCP檢測33-34
• 2.7 基因克隆與測序34-36
• 3 數(shù)據(jù)分析方法36-39
• 3.1 生物信息學分析方法36
• 3.2 實時熒光定量數(shù)據(jù)分析方法36-37
• 3.3 基因多態(tài)性分析方法37-39
• 第三章 結(jié)果與分析39-56
• 1 藏綿羊PHD2基因生物信息學分析39-49
• 1.1 藏綿羊PHD2基因PCR擴增結(jié)果39
• 1.2 藏綿羊擴增序列比對39-40
• 1.3 藏綿羊PHD2蛋白理化性質(zhì)分析40-41
• 1.4 亞細胞定位41
• 1.5 信號肽剪切位點預測41-42
• 1.6 跨膜螺旋結(jié)構(gòu)預測42-43
• 1.7 磷酸化和糖基化位點預測43
• 1.8 保守結(jié)構(gòu)域分析43-44
• 1.9 親疏水性分析44-45
• 1.10 功能預測與分析45-47
• 1.11 二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預測分析47-49
• 2 綿羊PHD2基因各組織表達差異49-52
• 2.1 總RNA提取瓊脂糖電泳質(zhì)量檢測49
• 2.2 目的基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測49-50
• 2.3 目的基因RT-qPCR動力學曲線分析50-51
• 2.4 目的基因RT-qPCR溶解曲線分析51
• 2.5 目的基因在綿羊不同組織中的表達分析51-52
• 3 綿羊PHD2基因多態(tài)性遺傳特征52-56
• 3.1 PCR擴增檢測52
• 3.2 SSCP檢測52-53
• 3.3 等位基因序列比對53-54
• 3.4 群體遺傳特性分析54-56
• 第四章 討論56-59
• 1 藏綿羊PHD2基因生物信息學特征56-57
• 2 綿羊PHD2基因mRNA表達差異57
• 3 綿羊PHD2基因變異特征57-59
• 第五章 結(jié)論59-60
• 參考文獻60-66
• 附件66-68
• 致謝68-69
• 作者簡介69-70
• 導師簡介70-71

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  本文關鍵詞：綿羊PHD2基因克隆、表達及變異分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：321887