本文關(guān)鍵詞：逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑類藥物對(duì)雞逆轉(zhuǎn)錄病毒的抑制作用及藥物選擇壓下禽白血病病毒耐藥毒株的產(chǎn)生，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：禽白血病病毒(ALV)、禽網(wǎng)狀組織增生癥病毒(REV)與人的艾滋病病毒(HIV)同屬于反轉(zhuǎn)錄病毒,由于反轉(zhuǎn)錄病毒極易突變的特性,迄今為止,由此類病毒引起的疾病均沒(méi)有有效的疫苗,但是針對(duì)艾滋病,目前已經(jīng)研發(fā)出很多藥物能夠?qū)Σ《井a(chǎn)生抑制作用而使疾病得到一定的控制。本研究室在禽白血病病毒沒(méi)有有效疫苗和目前使用的很多弱毒疫苗都存在REV污染并無(wú)有效方法去除的現(xiàn)狀的基礎(chǔ)上,根據(jù)病毒具有相似性的原理,利用對(duì)艾滋病有抑制作用的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑類藥物,試圖探索此類藥物在輔助禽白血病病毒凈化中的可行性和在去除疫苗毒種中REV污染的可操作性。1、不同藥物及其組合對(duì)ALV和REV的體外抑制作用及其應(yīng)用首先通過(guò)在培養(yǎng)液中添加不同藥物濃度連續(xù)傳代以及利用CCK-8測(cè)定細(xì)胞活性的方法,確定了培養(yǎng)液中添加不超過(guò)5ug/ml的藥物濃度對(duì)于DF-1細(xì)胞的復(fù)制沒(méi)有影響。針對(duì)ALV的實(shí)驗(yàn)證實(shí),當(dāng)在培養(yǎng)液中添加不同的藥物濃度時(shí),藥物濃度與抗病毒作用呈現(xiàn)正相關(guān)性,即藥物濃度越高,對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用越高;在針對(duì)REV的證實(shí),當(dāng)在培養(yǎng)液中分別添加5ug/ml的AZT或LAM以及兩者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)均可以顯著抑制REV在DF-1細(xì)胞上的復(fù)制,通過(guò)在新城疫弱毒疫苗中人為添加REV模擬AZT或LAM以及兩者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)疫苗毒種中REV污染的凈化作用,結(jié)果顯示經(jīng)藥物干預(yù)4代后即將REV去除,并且凈化后毒種檢驗(yàn)合格。本研究證實(shí)了AZT或LAM在體外對(duì)REV的抑制作用,并在人工模擬實(shí)驗(yàn)中成功凈化了疫苗毒種中污染的REV。2、在藥物選擇壓下禽白血病病毒耐藥毒株的產(chǎn)生經(jīng)細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)和對(duì)病毒的抑制作用實(shí)驗(yàn)選定3ug/ml的AZT藥物濃度作為藥物選擇壓傳代的最適濃度,在6孔細(xì)胞板中分別設(shè)置3個(gè)用藥組和3個(gè)不添加藥物組,在細(xì)胞上連傳50代后,將6個(gè)毒株進(jìn)行定量,再以相同的病毒量接種細(xì)胞,分別在0ug/ml、1ug/ml、3ug/ml、5ug/ml的濃度下進(jìn)行培養(yǎng),通過(guò)測(cè)定各組的p27判斷出在3ug/ml藥物濃度下,連傳50代出現(xiàn)了耐藥毒株。3、不同藥物及其組合對(duì)ALV-J在海蘭褐雞體內(nèi)復(fù)制的抑制作用通過(guò)給不同組別的雞分別注射不同劑量的AZT后通過(guò)每周稱重和檢測(cè)對(duì)NDV和AIV-H9的抗體評(píng)估不同劑量AZT對(duì)雞體重和免疫功能的影響,結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,體重和抗體水平差異均不顯著。在人工攻毒ALV-J后,通過(guò)每周采集雞抗凝血檢測(cè)病毒血癥陽(yáng)性率,結(jié)果表明與不使用藥物的對(duì)照組的持續(xù)病毒血癥相比,10mg藥物組的病毒血癥在前6周沒(méi)有出現(xiàn),5mg藥物組病毒血癥在第7周時(shí)完全消失。綜上所述,本研究不僅證實(shí)了AZT和LAM以及兩種藥物的聯(lián)合用藥對(duì)雞反轉(zhuǎn)錄病毒的抑制作用,并且成功應(yīng)用于降低ALV感染水平和去除疫苗中的REV污染,還構(gòu)建了對(duì)AZT產(chǎn)生耐藥性的ALV-J毒株,為進(jìn)一步研究反轉(zhuǎn)錄病毒的耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制提供了良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br/> 【關(guān)鍵詞】：禽白血病病毒 逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑類藥物 齊多夫定 拉米夫定 網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 符號(hào)說(shuō)明5-11
• 中文摘要11-13
• Abstract13-15
• 1 前言15-37
• 1.1 禽白血病病毒的研究進(jìn)展15-23
• 1.1.1 禽白血病病毒的分類地位16
• 1.1.2 亞群分類16-17
• 1.1.3 J亞群禽白血病病毒的形態(tài)學(xué)與理化特征17-18
• 1.1.3.1 形態(tài)學(xué)特征17
• 1.1.3.2 理化特征17-18
• 1.1.4 J亞群禽白血病病毒的基因組結(jié)構(gòu)及蛋白組成18-20
• 1.1.4.1 gag/pro基因及編碼蛋白18-19
• 1.1.4.2 pol基因及編碼蛋白19
• 1.1.4.3 env基因及編碼蛋白19
• 1.1.4.4 UTR區(qū)19-20
• 1.1.4.5 LTR區(qū)20
• 1.1.5 J亞群禽白血病病毒的復(fù)制周期20-21
• 1.1.6 流行病學(xué)特點(diǎn)21-22
• 1.1.7 J亞群禽白血病病毒的致病性研究22
• 1.1.8 ALV-J的診斷22
• 1.1.9 ALV-J的預(yù)防22-23
• 1.2 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥（REV）的研究進(jìn)展23-29
• 1.2.1 病原學(xué)23-25
• 1.2.1.1 病毒分類及毒株分類23
• 1.2.1.2 核酸及蛋白質(zhì)組成23-24
• 1.2.1.3 病毒復(fù)制24-25
• 1.2.1.4 病毒穩(wěn)定性25
• 1.2.2 流行病學(xué)25-27
• 1.2.2.1 水平傳播途徑25-26
• 1.2.2.2 垂直傳播途徑26
• 1.2.2.3 昆蟲(chóng)傳播途徑26
• 1.2.2.4 疫苗污染途徑26-27
• 1.2.3 發(fā)病機(jī)理27
• 1.2.4 臨床及病理變化27-28
• 1.2.4.1 病理變化27
• 1.2.4.2 生長(zhǎng)抑制綜合征27-28
• 1.2.5 診斷28
• 1.2.5.1 病毒分離及鑒定28
• 1.2.5.2 血清學(xué)檢測(cè)28
• 1.2.6 預(yù)防和控制28-29
• 1.3 艾滋病研究進(jìn)展29-36
• 1.3.1 病原學(xué)29-30
• 1.3.1.1 病毒分類及毒株分類29
• 1.3.1.2 病毒結(jié)構(gòu)及核酸和蛋白質(zhì)組成29-30
• 1.3.2 病毒的復(fù)制30-31
• 1.3.3 艾滋病的臨床藥物治療31-33
• 1.3.3.1 藥物作用靶點(diǎn)及作用原理31-32
• 1.3.3.2 臨床治療藥物和治療方案32-33
• 1.3.4 HIV逆轉(zhuǎn)錄酶及其抑制劑33-36
• 1.3.4.1 逆轉(zhuǎn)錄酶及臨床應(yīng)用33
• 1.3.4.2 核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的作用機(jī)理33
• 1.3.4.3 臨床應(yīng)用的HIV-1 核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NRTIs）33-34
• 1.3.4.4 齊多夫定（AZT）34-35
• 1.3.4.5 拉米夫定（LAM）35-36
• 1.4 本研究的目的和意義36-37
• 2 材料與方法37-46
• 2.1 試驗(yàn)材料37-38
• 2.1.1 毒株和細(xì)胞37
• 2.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物37
• 2.1.3 主要試劑和試劑盒37-38
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)主要使用的藥物38
• 2.2 方法38-46
• 2.2.1 不同藥物濃度的配制方法38
• 2.2.2 連續(xù)傳代法確定DF-1 細(xì)胞復(fù)制無(wú)影響的藥物濃度38
• 2.2.3 CCK-8 測(cè)定藥物對(duì)DF-1 細(xì)胞活性的影響38-39
• 2.2.4 不同藥物濃度對(duì)ALV-J在DF-1 細(xì)胞復(fù)制的抑制作用39-40
• 2.2.5 Reed-Muench法方法測(cè)定TCID5040
• 2.2.6 NX0101株在藥物選擇壓下的連續(xù)傳代40
• 2.2.7 NX0101株在藥物選擇壓下的耐藥性形成的驗(yàn)證40-41
• 2.2.8 不同藥物濃度對(duì)海蘭褐雞生產(chǎn)性能的影響41
• 2.2.9 血凝血抑測(cè)定抗體滴度41-42
• 2.2.10 不同藥物濃度對(duì)ALV-J在海蘭褐雞體內(nèi)復(fù)制的抑制作用42
• 2.2.11 不同藥物濃度對(duì)REV在DF-1 細(xì)胞上復(fù)制的抑制作用42-43
• 2.2.12 疫苗毒種中REV污染去除（潔凈性）的檢驗(yàn)43
• 2.2.13 藥物干預(yù)后毒種接種SPF雞的檢驗(yàn)43
• 2.2.14 ELLISA測(cè)定血清中REV抗體43-44
• 2.2.15 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)：44-46
• 3 結(jié)果46-54
• 3.1 AZT對(duì)ALV-J在體內(nèi)和體外的抑制作用46-50
• 3.1.1 不同AZT添加濃度對(duì)DF-1 細(xì)胞復(fù)制的影響46
• 3.1.2 不同AZT添加濃度對(duì)DF-1 細(xì)胞活性的影響46-47
• 3.1.3 不同AZT添加濃度對(duì)ALV-J在DF-1 細(xì)胞復(fù)制的抑制作用47-48
• 3.1.4 不同濃度AZT對(duì)海蘭褐雞生產(chǎn)性能的影響48-49
• 3.1.5 不同藥物濃度對(duì)NDV和AIV-H9免疫后抗體反應(yīng)的影響49-50
• 3.1.6 不同劑量AZT對(duì)ALV-J在海蘭褐雞內(nèi)復(fù)制的抑制作用50
• 3.2 在藥物選擇壓下ALV-J耐藥毒株的形成50-52
• 3.2.1 第50代不同傳代系耐藥性形成的驗(yàn)證50-52
• 3.3 利用逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑類藥物去除疫苗中的REV污染52-54
• 3.3.1 不同濃度AZT和LAM對(duì)REV在細(xì)胞復(fù)制的抑制作用52
• 3.3.2 AZT和LAM單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用去除疫苗毒種中REV污染52-53
• 3.3.3 IFA檢測(cè)凈化后疫苗毒種中REV53
• 3.3.4 SPF雞接種法檢測(cè)凈化后疫苗毒種中REV污染53-54
• 4 討論54-57
• 5 結(jié)論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-64
• 致謝64-65
• 碩士期間發(fā)表的論文65

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