本文關(guān)鍵詞：穩(wěn)定表達(dá)SHEV ORF3的HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)導(dǎo)致的肝炎已經(jīng)成為一個(gè)重要的世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題,嚴(yán)重影響著人類的生活。SHEV是一種以豬作為宿主的HEV。ORF3蛋白作為一種調(diào)控蛋白,影響著靶細(xì)胞的多種信號(hào)通路。為了揭示SHEV ORF3對(duì)靶細(xì)胞的作用機(jī)理,本研究實(shí)驗(yàn)一根據(jù)SHEV ORF3基因序列,設(shè)計(jì)該基因的上下游引物,通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從pET42a-ORF3質(zhì)粒中克隆出基因ⅣV型MEVORF3基因,同時(shí)與綠色熒光表達(dá)載體pEGFP-N1進(jìn)行雙酶切,構(gòu)建pEGFP-ORF3和pEGFP慢病毒載體,將慢病毒載體在HEK 293T細(xì)胞內(nèi)包裝成病毒顆粒,將病毒顆粒感染HepG2細(xì)胞,篩選單克隆細(xì)胞,使pEGFP-ORF3和pEGFP在HepG2細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)和Western blotting進(jìn)行鑒定,成功建立了HepG2-pEGFP-ORF3穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)二提取HepG2-pEGFP-ORF3穩(wěn)定細(xì)胞系的總RNA,應(yīng)用RNA-seq對(duì)HepG2-pEGFP-ORF3細(xì)胞系進(jìn)行測(cè)序,分析差異基因表達(dá)的情況,qRT-PCR對(duì)差異基因進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證,通過(guò)Gene Ontology對(duì)差異顯著的基因進(jìn)行分類。結(jié)果表明,在ORF3的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系HepG2-pEGFP-ORF3中,HepG2細(xì)胞的CLDN6、YLPM1、 APOC3、NLRP1、SCARA3、FGA、FGG、FGB和FREM1基因的mRNA水平表達(dá)上調(diào)；而SLC2A3、DKK1、BPIFB2和PTGR1基因的mRNA水平下調(diào)。其中,CLDN6和FREM1基因的表達(dá)失調(diào)可能導(dǎo)致膜蛋白表達(dá)以及基底膜蛋白的完整性失調(diào)；NLRP1的表達(dá)失調(diào)可能會(huì)引起HepG2細(xì)胞的凋亡；PTGR1的表達(dá)失調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致HepG2細(xì)胞凋亡。尤其值得注意的是,APOC3、SCARA3和DKK1的表達(dá)失調(diào),可能影響到HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)代謝。本研究為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)SHEV ORF3的功能提供了科學(xué)的線索,對(duì)揭示SHEV的致病機(jī)理及HE的治療具有重要意義。
【關(guān)鍵詞】：豬戊型肝炎病毒 開(kāi)放閱讀框3 人肝癌細(xì)胞 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 綜述9-19
• 1 HEV的研究進(jìn)展9-15
• 1.1 HEV的研究概況9-10
• 1.2 HEV分子流行病學(xué)10
• 1.3 HEV基因類型及分布10-11
• 1.4 HEV的基因組結(jié)構(gòu)11-13
• 1.5 HEV ORF3蛋白研究進(jìn)展13-15
• 1.5.1 ORF3蛋白結(jié)構(gòu)13
• 1.5.2 ORF3蛋白功能13-15
• 2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的研究進(jìn)展15-18
• 2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序15
• 2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序原理及應(yīng)用15-18
• 2.2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序步驟15-16
• 2.2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序原理16
• 2.2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序應(yīng)用16-18
• 3 研究目的及意義18-19
• 第二章 建立穩(wěn)定表達(dá)SHEV ORF3基因的HepG2細(xì)胞系19-36
• 1 實(shí)驗(yàn)材料19-23
• 1.1 細(xì)胞和菌種19-20
• 1.2 主要試劑20-21
• 1.3 主要儀器21
• 1.4 主要溶液配制方法21-23
• 1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)以及常用溶液配制21-22
• 1.4.2 Western blotting常用溶液配制22-23
• 2 實(shí)驗(yàn)方法23-32
• 2.1 穩(wěn)定細(xì)胞系的建立23-32
• 2.1.1 HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)23-25
• 2.1.2 慢病毒載體的構(gòu)建25-28
• 2.1.3 慢病毒包裝28
• 2.1.4 慢病毒感染HepG2細(xì)胞28
• 2.1.5 穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選28-29
• 2.1.6 流式細(xì)胞術(shù)鑒定29
• 2.1.7 Western blotting鑒定29-32
• 3 結(jié)果與分析32-34
• 3.1 穩(wěn)定細(xì)胞系的建立及鑒定32-34
• 3.1.1 慢病毒綠色熒光蛋白感染HepG2的效率觀察32
• 3.1.2 單克隆細(xì)胞的鑒定32-33
• 3.1.3 Western blotting鑒定33-34
• 4 討論34-36
• 第三章 穩(wěn)定表達(dá)SHEV ORF3基因的HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析36-55
• 1 實(shí)驗(yàn)材料36-38
• 1.1 細(xì)胞36
• 1.2 主要試劑36-37
• 1.3 主要儀器37
• 1.4 主要溶液配制方法37-38
• 2 實(shí)驗(yàn)方法38-42
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與樣本收集38
• 2.2 穩(wěn)定細(xì)胞系總RNA的提取38
• 2.3 mRNA的建庫(kù)和測(cè)序38-39
• 2.4 RNA-seq分析39-40
• 2.4.1 測(cè)序數(shù)據(jù)處理39-40
• 2.4.2 基因水平差異表達(dá)研究40
• 2.5 差異基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證40-42
• 2.5.1 總RNA的反轉(zhuǎn)錄40-41
• 2.5.2 qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)mRNA41-42
• 2.6 差異表達(dá)mRNA分析42
• 3 結(jié)果與分析42-53
• 3.1 測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)處理結(jié)果42-43
• 3.2 參考基因組比對(duì)43-45
• 3.2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組比對(duì)的reads統(tǒng)計(jì)43-44
• 3.2.2 參考基因組比對(duì)區(qū)域以及密度分布44-45
• 3.3 基因表達(dá)水平分析45-47
• 3.3.1 基因表達(dá)值分布45-46
• 3.3.2 基因表達(dá)值密度46-47
• 3.4 差異基因表達(dá)水平分析47-52
• 3.4.1 差異基因表達(dá)水平火山圖分析47-48
• 3.4.2 Venn圖篩選共有差異表達(dá)基因48-49
• 3.4.3 共有差異表達(dá)基因熱圖49-52
• 3.5 qRT-PCR驗(yàn)證52
• 3.6 顯著差異表達(dá)基因GO聚類分析52-53
• 4 討論53-55
• 結(jié)論55-56
• 英文縮略對(duì)照表56-58
• 參考文獻(xiàn)58-66
• 附錄66-74
• 致謝74

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：298447