本文關(guān)鍵詞：拉米夫定對(duì)禽白血病病毒的體內(nèi)外抑制效應(yīng)及其應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：禽白血病(Avian leukemia,AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)引起的禽類多種良性和惡性腫瘤性疾病,臨床上多以免疫抑制、生長(zhǎng)抑制和多器官組織出現(xiàn)腫瘤等為主要特征,其傳播主要通過垂直傳播。此外,由于一些弱毒疫苗中污染了ALV也給規(guī)�；B(yǎng)雞業(yè)和家禽疫苗產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的危害。目前尚無有效的商品化疫苗用于ALV的預(yù)防。ALV與人獲得性免疫缺陷綜合癥病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)同屬于反轉(zhuǎn)錄病毒,鑒于通過多種藥物及其組合已經(jīng)較好的控制了HIV,我們有興趣知道類似的藥物是否可以輔助降低外源性ALV的感染率或用于去除疫苗中ALV污染。本研究觀察了逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑類藥物拉米夫定(Lamivudine,LAM)對(duì)ALV-J在體外和體內(nèi)的抑制作用并成功在模擬實(shí)驗(yàn)中將新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)弱毒疫苗中ALV-A污染去除。1、不同濃度LAM對(duì)ALV-J體外抑制作用及其應(yīng)用首先通過在不同藥物濃度培養(yǎng)液中細(xì)胞的連續(xù)傳代和CCK-8細(xì)胞毒性測(cè)定兩種方法確定了在培養(yǎng)液中添加不超5 ug/ml的LAM對(duì)于DF-1細(xì)胞復(fù)制沒有影響。為了解不同濃度LAM對(duì)ALV-J在體外的抑制作用,實(shí)驗(yàn)將J亞群r NX0101株接種到DF-1細(xì)胞上,然后在不同孔中分別使用20 ug/ml,10 ug/ml,5 ug/ml,1 ug/ml LAM的維持液培養(yǎng)以測(cè)定病毒復(fù)制動(dòng)態(tài)。結(jié)果顯示,5 ug/ml的安全用藥范圍內(nèi),其抗病毒作用與其濃度呈正相關(guān),即隨著藥物濃度的增加,r NX0101的復(fù)制受到抑制作用隨之增強(qiáng)。按照類似操作觀察了LAM對(duì)ALV-A也有明顯的抑制作用。將人為污染ALV-A的NDV疫苗毒種經(jīng)過5 ug/ml的LAM連續(xù)干預(yù)2代后,經(jīng)接種SPF雞、病毒分離以及核酸檢測(cè)確認(rèn)成功將其中人為污染的ALV去除。2、藥物選擇壓下ALV耐藥毒株的產(chǎn)生經(jīng)細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)和對(duì)病毒的抑制作用實(shí)驗(yàn)確定5 ug/ml為ALV復(fù)制被顯著抑制但可以繼續(xù)復(fù)制的藥物濃度用于構(gòu)建藥物選擇壓,在6孔細(xì)胞板中分別設(shè)置用藥組和空白組。連傳60代后,將原始毒株、第六十代用藥組病毒及第六十代未用藥組病毒進(jìn)行準(zhǔn)確定量,以相同病毒量接種細(xì)胞,分別觀察同等接種劑量在添加0 ug/ml和5 ug/ml的LAM后不同毒株復(fù)制曲線,結(jié)果顯示5 ug/ml藥物濃度下,對(duì)原始毒株抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)藥物選擇壓下的傳代毒株,證實(shí)出現(xiàn)了對(duì)LAM產(chǎn)生耐藥性的ALV-J毒株。3、不同劑量LAM對(duì)ALV-J在海蘭褐雞體內(nèi)復(fù)制的抑制作用給不同組別的雞分別使用不同劑量的LAM后通過定期稱重并檢測(cè)針對(duì)NDV和AIV-H9的抗體評(píng)估不同劑量LAM對(duì)雞體重和免疫功能的影響,結(jié)果顯示分別使用1mg,4 mg和6 mg的藥物組其體重以及AIV-H9和NDV抗體與未空白對(duì)照組相比差異均不顯著。將不同組別的雞人工攻毒后分別使用不同劑量的藥物連續(xù)用藥一周,從第一周起每只雞采集抗凝血檢測(cè)各組病毒血癥陽(yáng)性率。結(jié)果顯示,未使用LAM的ALV-J感染組在感染后21 d時(shí)有85.00%轉(zhuǎn)為病毒血癥陽(yáng)性,并且直到105 d時(shí)還維持在一個(gè)較高的病毒血癥水平(65.00%),而使用4 mg LAM的感染組在63 d時(shí)即轉(zhuǎn)為病毒血癥陰性。使用1 mg LAM的用藥組盡管沒有完全消除ALV-J的感染,但病毒血癥陽(yáng)性率也明顯低于未使用藥物的感染組。綜上所述,本研究不僅證實(shí)了LAM對(duì)ALV-J在體內(nèi)外的抑制作用并成功應(yīng)用于降低ALV-J感染和去除ALV-A污染,還構(gòu)建了藥物選擇壓下ALV-J的連續(xù)傳代系列,為進(jìn)一步研究逆轉(zhuǎn)錄病毒耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制打下來良好的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：禽白血病病毒 拉米夫定 抑制作用 疫苗污染 耐藥性
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要10-12
• Abstract12-15
• 1 前言15-28
• 1.1 禽白血病病毒（ALV）的研究進(jìn)展15-21
• 1.1.1 病原學(xué)15-17
• 1.1.2 病毒復(fù)制17-18
• 1.1.3 流行病學(xué)18-19
• 1.1.4 ALV-J致病性19-20
• 1.1.5 ALV-J抗體和病毒血癥存在情況20
• 1.1.6 ALV-J的診斷20-21
• 1.1.7 ALV-J的預(yù)防21
• 1.2 HIV的研究進(jìn)展21-27
• 1.2.1 病原學(xué)22
• 1.2.2 病毒的復(fù)制22-23
• 1.2.3 HIV的檢測(cè)23
• 1.2.4 發(fā)病機(jī)理23-24
• 1.2.5 治療藥物24-27
• 1.2.6 HIV耐藥性檢測(cè)27
• 1.3 本試驗(yàn)研究的目的和意義27-28
• 2 材料和方法28-37
• 2.1 材料28-29
• 2.1.1 細(xì)胞、病毒與抗體28-29
• 2.1.2 藥物與疫苗29
• 2.1.3 主要試劑及儀器29
• 2.2 方法29-37
• 2.2.1 不同濃度藥物的配制29-30
• 2.2.2 細(xì)胞安全藥物濃度的確定30
• 2.2.3 不同濃度LAM對(duì)ALV-J體外抑制實(shí)驗(yàn)30
• 2.2.4 ALV-p27抗原檢測(cè)30-31
• 2.2.5 藥物選擇壓下的細(xì)胞連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)31-32
• 2.2.6 不同濃度LAM對(duì)海蘭褐雞生產(chǎn)性能影響實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)32
• 2.2.7 體重指數(shù)測(cè)定32
• 2.2.8 NDV和AIV-H9滅活疫苗的免疫和抗體水平的測(cè)定32
• 2.2.9 血凝血抑測(cè)定抗體滴度32-33
• 2.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析33
• 2.2.11 不同劑量LAM對(duì)ALV-J在海蘭褐雞內(nèi)復(fù)制的抑制實(shí)驗(yàn)33-34
• 2.2.12 病毒分離34
• 2.2.13 人工模擬應(yīng)用LAM去除疫苗毒種中ALV-A污染實(shí)驗(yàn)34
• 2.2.14 抗體檢測(cè)34-35
• 2.2.15 病毒RNA的提取35
• 2.2.16 RT-PCR35-36
• 2.2.17 斑點(diǎn)分子雜交36-37
• 3 結(jié)果37-43
• 3.1 DF-1 細(xì)胞安全藥物濃度確定37-38
• 3.2 第六十代耐藥毒株的驗(yàn)證38-39
• 3.3 不同LAM添加濃度對(duì)ALV-J體外復(fù)制的抑制作用39-40
• 3.4 不同濃度LAM對(duì)海蘭褐雞生長(zhǎng)速度的影響40-41
• 3.5 不同濃度LAM對(duì)NDV和AIV-H9免疫的抗體反應(yīng)的影響41-42
• 3.6 不同劑量LAM對(duì)ALV-J在海蘭褐雞體內(nèi)復(fù)制的抑制作用42
• 3.7 應(yīng)用LAM去除疫苗毒種中ALV-A污染42-43
• 4 討論43-47
• 4.1 不同濃度LAM對(duì)ALV-J體外抑制實(shí)驗(yàn)44-45
• 4.2 藥物選擇壓下耐藥毒株的產(chǎn)生45
• 4.3 不同劑量LAM對(duì)ALV-J在海蘭褐雞內(nèi)復(fù)制的抑制實(shí)驗(yàn)45-46
• 4.4 人工模擬應(yīng)用LAM去除疫苗毒種中ALV-A污染實(shí)驗(yàn)46-47
• 5 結(jié)論47-48
• 6 參考文獻(xiàn)48-56
• 7 致謝56-57
• 8 碩士期間發(fā)表的論文57

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