本文關(guān)鍵詞：脫氧核酶對鴨甲肝病毒IRES元件的靶向抑制作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：為尋找基因水平治療鴨甲肝病毒(DHAV)的可行性靶位點,我們對DHAV的內(nèi)部核糖體進入位點序列(Internal Ribosome Entry Site, IRES)元件設(shè)計合成了6條(DZ369、DZ454、DZ514、DZ454-7、DZ454-9和DZ000)脫氧核酶(DNAzyme),開展了DNAzyme對IRES元件切割、對DHAV復(fù)制的抑制作用研究,獲得如下結(jié)果。以構(gòu)建的pGEM-T/IRES質(zhì)粒為模板,通過T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄得到含有IRES結(jié)構(gòu)元件的RNA單鏈產(chǎn)物(DHAV-RNA),長度約為361m,在金屬離子Mg2+存在的情況下,DHAV-RNA與DNAzyme進行相互作用后5.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,結(jié)果顯示具有完整的酶切活性中心和與底物完全互補配對的側(cè)翼結(jié)構(gòu)的DZ369、DZ454和DZ514均能在靶RNA的G-C或者A-C位點進行切割反應(yīng),而只有完整酶切活性中心不具備切割底物的識別結(jié)構(gòu)域的無關(guān)對照組DZ000,不能對靶RNA進行有效切割,表明DNAzyme對IRES的切割反應(yīng)具有很強的特異性。DNAzymes需要二價金屬離子的輔助才能更好地發(fā)揮作用,并且在不同金屬離子的作用下,DNAzymes對IRES表現(xiàn)出不同的切割活性,其中Mg2+對DNAzymes的活性表現(xiàn)出最強的促進作用,其余依次是Zn2+、Mn2+、Ni2+和Co2+。將含有IRES結(jié)構(gòu)元件的目的基因和Red基因克隆到pEGFP-N1中,得到雙表達載體pEGFP-Red-IRES-N1并轉(zhuǎn)染DEF細胞中,成功表達出Red和EGFP熒光蛋白。與陽性對照組相比,重組克隆載體的綠色熒光蛋白的表達量只能到達對照組的60-65%,且IRES依賴性的EGFP開始表達的時間比帽子依賴性的時間更延后,說明IRES能起始其下游基因的表達,但是活性沒有CMV啟動子的強。隨后將雙表達載體pEGFP-Red-IRES-N1和DNAzyme共轉(zhuǎn)染DEF細胞,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染DNAzyme的試驗組中EGFP表達受到了抑制,最強抑制作用出現(xiàn)在10μmol/L的DZ454組,而DNAzyme側(cè)翼長度的改變沒有影響其活性。與對照組相比Red蛋白的表達量沒有差異,表明IRES起始的蛋白的表達是相對獨立的。另外一個重要的結(jié)果是在DZ454對DHAV-1全病毒復(fù)制的抑制作用的試驗中,用一步熒光定量RT-PCR(FQRT-PCR)的方法檢測細胞碎片中不同時間點3D基因的表達情況。結(jié)果顯示,到第60 h時病毒的復(fù)制量達到最大值,之后保持不變,且在病毒復(fù)制的整個過程中DZ454通過對IRES的剪切而發(fā)揮對DHAV-1復(fù)制的抑制作用,在第72 h時抑制率達到了最大值(10.38%),之后保持不變。綜上,在有二價金屬離子的參與下,DNAzyme能對DHAV的IRES的特定位點進行有效切割,在DEF中也對DHAV復(fù)制表現(xiàn)出了一定的抑制作用,結(jié)果為進一步探索DHAV感染的治療提供了可參考的數(shù)據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：DHAV-1 IRES元件 脫氧核酶
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要3-4
• Abstract4-6
• 部分縮寫及符號說明6-10
• 1 文獻綜述10-17
• 1.1.1 型鴨甲肝病毒的簡介10-11
• 1.1.1 DHAV-1的理化和生物學(xué)特性10
• 1.1.2 DHAV的分子結(jié)構(gòu)10-11
• 1.1.3 常見病毒蛋白質(zhì)的翻譯機制11
• 1.2 IRES的研究概況11-16
• 1.2.1 IRES的發(fā)現(xiàn)及分類12
• 1.2.2 IRES的二級結(jié)構(gòu)12-13
• 1.2.3 參與IRES翻譯起始的調(diào)控因素13-14
• 1.2.4 IRES的應(yīng)用及活性14-15
• 1.2.5 IRES在基因治療中充當(dāng)靶位點的作用15-16
• 1.3 脫氧核酶的研究概況16-17
• 1.3.1 脫氧核酶的發(fā)現(xiàn)16
• 1.3.2 脫氧核酶的特性16-17
• 1.3.3 脫氧核酶的應(yīng)用17
• 1.4 選題目的及意義17
• 2 試驗研究17-33
• 2.1 試驗材料17-19
• 2.1.1 毒株和菌種17
• 2.1.2 主要試劑17-18
• 2.1.3 其他試驗材料18
• 2.1.4 常用試劑的配制18-19
• 2.2 主要儀器設(shè)備19
• 2.3 試驗方法19-33
• 2.3.1 DNAzymes對DHAV-RNA的體外切割試驗19-25
• 2.3.2 含IRES結(jié)構(gòu)元件的重組載體pEGFP-Red-IRES-N1構(gòu)建25-29
• 2.3.3 在DEF中DNAzymes對IRES活性的抑制作用29-31
• 2.3.4 DZ454對DHAV-1全病毒復(fù)制的抑制作用31-33
• 3 試驗結(jié)果33-47
• 3.1 DHAV-1 IRES的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測33
• 3.2 含有IRES結(jié)構(gòu)元件目的基因的T克隆及體外轉(zhuǎn)錄33-35
• 3.2.1 目的基因的PCR擴增33-34
• 3.2.2 含有IRES結(jié)構(gòu)元件目的基因的T克隆34
• 3.2.3 DHAV-RNA體外轉(zhuǎn)錄物完整性的檢測34-35
• 3.3 DNAzymes對IRES的體外切割試驗35-36
• 3.3.1 在Mg~(2+)參與下各種DNAzymes對IRES的切割作用35
• 3.3.2 在不同金屬離子的參與下DNAzymes對IRES的切割作用35-36
• 3.4 重組質(zhì)粒pEGFP-Red-IRES-N1的構(gòu)建及表達36-40
• 3.4.1 含有IRES結(jié)構(gòu)元件目的基因和Red基因的PCR擴增36-37
• 3.4.2 含有IRES結(jié)構(gòu)元件目的基因和Red基因的T克隆37-38
• 3.4.3 含有IRES結(jié)構(gòu)元件目的基因和Red基因的亞克隆38-39
• 3.4.4 重組質(zhì)粒的表達39-40
• 3.5 在DEF中DNAzymes對IRES的抑制作用40-45
• 3.5.1 DNAzymes對細胞毒性的評估40-41
• 3.5.2 量效關(guān)系41-43
• 3.5.3 時效關(guān)系43-44
• 3.5.4 最適側(cè)翼長度44-45
• 3.6 DZ454對DHAV-1復(fù)制的抑制作用45-47
• 3.6.1 TCID_(50)的測定45
• 3.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建45-46
• 3.6.3 樣品的定量檢測46-47
• 4 討論47-50
• 5 結(jié)論50-51
• 參考文獻51-58
• 致謝58

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1 潘光錦,韓金祥;脫氧核酶的研究進展[J];生物工程進展;2001年05期

2 詹林盛,王全立,孫紅琰;脫氧核酶研究進展[J];生物化學(xué)與生物物理進展;2002年01期

3 洪潔華;劉曉波;呂小迅;;“10~23”型脫氧核酶的研究進展[J];國外醫(yī)學(xué)(藥學(xué)分冊);2007年02期

4 劉其友;張云波;趙朝成;趙東風(fēng);;脫氧核酶的應(yīng)用研究進展[J];化學(xué)與生物工程;2009年08期

5 李娜;朱道銀;;10-23脫氧核酶及其應(yīng)用進展[J];醫(yī)學(xué)綜述;2006年02期

6 王愛民;周國燕;;10-23脫氧核酶的研究進展[J];中國生物制品學(xué)雜志;2011年03期

7 王同慧;凌保東;;脫氧核酶在細菌研究領(lǐng)域的現(xiàn)狀與展望[J];中國抗生素雜志;2013年07期

8 楊玉成;洪蘇玲;;脫氧核酶及其基因治療應(yīng)用進展[J];重慶醫(yī)學(xué);2006年23期

9 廉國利;楊錫強;俞海國;趙曉東;;脫氧核酶在小鼠體內(nèi)抗呼吸道合胞病毒的效應(yīng)[J];陜西醫(yī)學(xué)雜志;2007年07期

10 楊中漢,馮建生;脫氧核酶:生物催化劑的新成員[J];生命的化學(xué);2000年02期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 孫侖泉;;新型基因抑制工具:脫氧核酶的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用[A];中國病理生理學(xué)會受體、腫瘤和免疫專業(yè)委員會聯(lián)合學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2010年

2 周娟;楊錫強;蔣利萍;王莉佳;崔玉霞;;特異性脫氧核酶抗呼吸道合胞病毒感染的體內(nèi)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第十四次全國兒科學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

3 姜大志;盛永杰;張今;;關(guān)鍵殘基嫁接實現(xiàn)錘頭核酶轉(zhuǎn)換脫氧核酶[A];第九屆全國酶學(xué)學(xué)術(shù)討論會暨鄒承魯誕辰85周年紀念會論文摘要集[C];2008年

4 劉彬;王雪麗;張華利;張今;李正強;;一種在生理條件下簡便、快速的測定脫氧核酶切割RNA反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)的方法[A];第七屆全國酶學(xué)學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C];2004年

5 溫曉玉;牛俊奇;王峰;田梅梅;;丙型肝炎病毒特異性脫氧核酶體外切割活性的初步研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第十二次全國病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2005年

6 蔣利萍;方平;王莉佳;;脫氧核酶抑制突變型p53基因表達的體外研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第十四次全國兒科學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

7 李慧;蔣利萍;解元元;李秋;方平;王莉佳;楊錫強;;“10-23”脫氧核酶細胞內(nèi)抑制甲型流感病毒復(fù)制的實驗研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第十四次全國兒科學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

8 于倩;劉奇峰;劉閨男;;早期生長反應(yīng)因子-1特異脫氧核酶對大鼠血管平滑肌細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-2表達的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會第11次心血管病學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2009年

9 裴仁軍;;基于脫氧核酶的生物網(wǎng)絡(luò)模塊的研究[A];中國化學(xué)會第28屆學(xué)術(shù)年會第4分會場摘要集[C];2012年

10 牛淑妍;姜禹;張書圣;;基于17E脫氧核酶特異性熒光檢測Pb~(2+)[A];第十屆中國化學(xué)會分析化學(xué)年會暨第十屆全國原子光譜學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2009年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 趙長安;脫氧核酶抗呼吸道合胞病毒效應(yīng)的體外研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2002年

2 姜大志;關(guān)鍵殘基嫁接產(chǎn)生新型脫氧核酶[D];吉林大學(xué);2008年

3 廉國利;脫氧核酶在小鼠體內(nèi)抗呼吸道合胞病毒的效應(yīng)[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2003年

4 劉彬;基于莖—環(huán)結(jié)構(gòu)構(gòu)建精確識別和切割底物的脫氧核酶[D];吉林大學(xué);2007年

5 于樂成;脫氧核酶抗丙型肝炎病毒活性的實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2003年

6 張迪;基于10-23脫氧核酶催化結(jié)構(gòu)域的新型化學(xué)修飾策略與高效脫氧核酶的發(fā)現(xiàn)及催化機制研究[D];沈陽藥科大學(xué);2010年

7 周娟;廣譜脫氧核酶抗不同免疫功能小鼠呼吸道合胞病毒感染的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2006年

8 盛永杰;酶編碼酶：脫氧核酶→核酶→肽酶[D];吉林大學(xué);2006年

9 邵曉珊;脫氧核酶抗甲型流感病毒的效應(yīng)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2009年

10 潘秀頡;內(nèi)皮素-1 10-23脫氧核酶的構(gòu)建及其抗急性缺血性心律失常的實驗研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2004年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 房克難;天然脫氧核酶的探索[D];吉林大學(xué);2011年

2 劉程程;類手槍脫氧核酶在糖傳感器中的設(shè)計應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2016年

3 姜瑩;I-R3脫氧核酶酶學(xué)性質(zhì)與構(gòu)效關(guān)系研究[D];吉林大學(xué);2016年

4 任松磊;基于脫氧核酶的新型重金屬離子熒光探針的研究[D];湖南大學(xué);2016年

5 魏玲;脫氧核酶對鴨甲肝病毒IRES元件的靶向抑制作用研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

6 孫宇;脫氧核酶的溫度依賴異構(gòu)化研究[D];吉林大學(xué);2009年

7 孫妍紅;環(huán)狀10-23結(jié)構(gòu)脫氧核酶的體內(nèi)外活性研究[D];吉林大學(xué);2004年

8 馮俊奎;順式天然脫氧核酶的探索[D];吉林大學(xué);2015年

9 許家翠;通過合理設(shè)計獲得新型脫氧核酶—錘頭脫氧核酶[D];吉林大學(xué);2006年

10 王琦;10-23脫氧核酶嘌呤堿基的結(jié)構(gòu)修飾與活性評價[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2011年

  本文關(guān)鍵詞：脫氧核酶對鴨甲肝病毒IRES元件的靶向抑制作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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