本文關(guān)鍵詞：牛CMYA1核心啟動子載體構(gòu)建及小鼠早期胚胎制備，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：CMYA1蛋白是心肌病相關(guān)蛋白,影響心臟的形態(tài)發(fā)育。CMYA1基因特異性的在心肌和骨骼肌中表達,并且在損傷的心肌細胞中會上調(diào)。本試驗通過CMYA1基因的核心啟動子連接二脂酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶1(DGAT1)構(gòu)建載體,以期獲得可以特異性改造牛肌肉性狀的高效載體,為將來獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)基因肉牛打下基礎。首先對牛CMYA1核心啟動子是否在牛肌肉中特異性啟動目的基因的表達進行驗證,具體操作是將試驗室之前構(gòu)建的由CMYA1核心啟動子啟動的pEGFP載體分別轉(zhuǎn)染牛肌細胞和牛成纖維細胞。結(jié)果顯示綠色熒光蛋白僅在牛肌細胞中表達。進一步驗證牛CMYA1基因核心啟動子的高效性,具體操作是將CMYA1核心啟動子連接目的基因DGAT1克隆到pcDNA3.1質(zhì)粒中,命名為XD。將試驗室之前構(gòu)建的肌酸激酶啟動子連接目的基因DGAT1克隆到pcDNA3.1質(zhì)粒中的載體命名為A293-4。載體XD、A293-4和空pcDNA3.1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染C2C12細胞。相對定量PCR顯示,XD組目的基因的表達量是A293-4組的6倍,是空質(zhì)粒組的30倍,證明了CMYA1核心啟動子具有高效性。本試驗通過原核注射法將XD載體注入小鼠受精卵中,結(jié)果顯示最佳的載體注射濃度為2mg/l,最佳的載體注射部位是雄原核,并成功的制備了小鼠的早期胚胎。為實驗室接下來開展轉(zhuǎn)基因小鼠動物模型的制備打下基礎。結(jié)論:1牛CMYA1基因核心啟動子具有牛肌細胞表達特異性。2牛CMYA1基因核心啟動子可以肌細胞中高效的啟動目的基因DGAT1的表達。3成功的制備了小鼠的早期胚胎。本試驗的意義在于獲得了特異性改變牛肌肉性狀的高效載體,不但為將來獲得具有優(yōu)良肉質(zhì)的轉(zhuǎn)基因牛打下基礎,而且為需要肌肉特異性表達載體的研究者提供了高效率并且特異性強的工具。
【關(guān)鍵詞】：CMYA1核心啟動子 肌肉特異性 高表達載體 原核注射
【學位授予單位】：天津農(nóng)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S823
【目錄】：

• 摘要12-13
• ABSTRACT13-14
• 第一章 引言14-29
• 1 CMYA1基因的研究進展14-16
• 2 DGAT1基因的研究進展16-18
• 3 本試驗采用的技術(shù)18-27
• 3.1 啟動子克隆18-21
• 3.2 定量PCR技術(shù)21-22
• 3.3 載體構(gòu)建技術(shù)22-25
• 3.4 細胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染25-27
• 3.4.1 細胞培養(yǎng)25-26
• 3.4.2 細胞轉(zhuǎn)染26-27
• 4 顯微注射的研究進展27-28
• 5 本研究的目的與意義28-29
• 第二章 CMYA1基因核心啟動子在牛肌肉細胞中的特異性表達29-34
• 1 材料29
• 1.1 細胞和菌液29
• 1.2 主要試劑和耗材29
• 1.3 主要儀器29
• 2 方法29-32
• 2.1 配置LB的液體培養(yǎng)基29
• 2.2 質(zhì)粒的提取29-30
• 2.3 細胞培養(yǎng)30-31
• 2.3.1 細胞的復蘇30-31
• 2.3.2 細胞的傳代31
• 2.3.3 細胞的凍存31
• 2.4 XE載體轉(zhuǎn)染牛的肌細胞和成纖維細胞31-32
• 3 結(jié)果與分析32-33
• 3.1 牛肌細胞的轉(zhuǎn)染32
• 3.2 牛成纖維細胞的轉(zhuǎn)染32-33
• 4 討論33-34
• 第三章 牛CMYA1基因核心啟動子高表達載體的構(gòu)建及驗證34-43
• 1 材料34
• 1.1 工具酶和試劑34
• 1.2 儀器設備34
• 1.3 測序和引物合成34
• 2 方法34-38
• 2.1 載體構(gòu)建34-35
• 2.1.1 PCR反應34-35
• 2.1.2 質(zhì)粒的酶切35
• 2.1.3 凝膠回收35
• 2.2 配置LB的固體培養(yǎng)基35-36
• 2.3 載體的連接36
• 2.4 載體的轉(zhuǎn)化36-37
• 2.4.1 感受態(tài)的制備36
• 2.4.2 轉(zhuǎn)化36-37
• 2.5 細胞轉(zhuǎn)染37
• 2.6 細胞cDNA的獲取37
• 2.6.1RNA抽提37
• 2.6.2 反轉(zhuǎn)錄37
• 2.7 PCR以及RT-PCR檢測37-38
• 3 結(jié)果和分析38-41
• 3.1 載體構(gòu)建38-39
• 3.2 細胞轉(zhuǎn)染39-40
• 3.3 定量PCR40-41
• 4 討論41-43
• 第四章 小鼠受精卵發(fā)育中XD載體的影響43-49
• 1 材料43
• 1.1 儀器和耗材43
• 1.2 試劑43
• 2 方法43-46
• 2.1 移卵針、持卵針、注射針的制備43-44
• 2.1.1 移卵針的拉制43
• 2.1.2 持卵針的拉制43
• 2.1.3 注射針的拉制43-44
• 2.2 試驗動物選擇44
• 2.3 雌性小鼠的超數(shù)排卵44
• 2.4 受精卵的采集及體外培養(yǎng)44
• 2.5 顯微操作44-46
• 2.5.1 注射針的準備44-45
• 2.5.2 顯微操作系統(tǒng)的準備45
• 2.5.3 顯微注射45-46
• 3 結(jié)果和分析46-48
• 3.1 小鼠受精卵的收集46
• 3.2 XD載體濃度對小鼠受精卵發(fā)育的影響46-47
• 3.3 原和注射對小鼠受精卵發(fā)育的影響47-48
• 4 討論48-49
• 第五章 結(jié)論49-50
• 參考文獻50-56
• 致謝56-57
• 附錄57-59
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文59

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  本文關(guān)鍵詞：牛CMYA1核心啟動子載體構(gòu)建及小鼠早期胚胎制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：286268