本文關(guān)鍵詞：牛CMYA1核心啟動子載體構(gòu)建及小鼠早期胚胎制備，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：CMYA1蛋白是心肌病相關(guān)蛋白,影響心臟的形態(tài)發(fā)育。CMYA1基因特異性的在心肌和骨骼肌中表達(dá),并且在損傷的心肌細(xì)胞中會上調(diào)。本試驗通過CMYA1基因的核心啟動子連接二脂酰甘油�；D(zhuǎn)移酶1(DGAT1)構(gòu)建載體,以期獲得可以特異性改造牛肌肉性狀的高效載體,為將來獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)基因肉牛打下基礎(chǔ)。首先對牛CMYA1核心啟動子是否在牛肌肉中特異性啟動目的基因的表達(dá)進(jìn)行驗證,具體操作是將試驗室之前構(gòu)建的由CMYA1核心啟動子啟動的pEGFP載體分別轉(zhuǎn)染牛肌細(xì)胞和牛成纖維細(xì)胞。結(jié)果顯示綠色熒光蛋白僅在牛肌細(xì)胞中表達(dá)。進(jìn)一步驗證牛CMYA1基因核心啟動子的高效性,具體操作是將CMYA1核心啟動子連接目的基因DGAT1克隆到pcDNA3.1質(zhì)粒中,命名為XD。將試驗室之前構(gòu)建的肌酸激酶啟動子連接目的基因DGAT1克隆到pcDNA3.1質(zhì)粒中的載體命名為A293-4。載體XD、A293-4和空pcDNA3.1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞。相對定量PCR顯示,XD組目的基因的表達(dá)量是A293-4組的6倍,是空質(zhì)粒組的30倍,證明了CMYA1核心啟動子具有高效性。本試驗通過原核注射法將XD載體注入小鼠受精卵中,結(jié)果顯示最佳的載體注射濃度為2mg/l,最佳的載體注射部位是雄原核,并成功的制備了小鼠的早期胚胎。為實驗室接下來開展轉(zhuǎn)基因小鼠動物模型的制備打下基礎(chǔ)。結(jié)論:1牛CMYA1基因核心啟動子具有牛肌細(xì)胞表達(dá)特異性。2牛CMYA1基因核心啟動子可以肌細(xì)胞中高效的啟動目的基因DGAT1的表達(dá)。3成功的制備了小鼠的早期胚胎。本試驗的意義在于獲得了特異性改變牛肌肉性狀的高效載體,不但為將來獲得具有優(yōu)良肉質(zhì)的轉(zhuǎn)基因牛打下基礎(chǔ),而且為需要肌肉特異性表達(dá)載體的研究者提供了高效率并且特異性強(qiáng)的工具。
【關(guān)鍵詞】：CMYA1核心啟動子 肌肉特異性 高表達(dá)載體 原核注射
【學(xué)位授予單位】：天津農(nóng)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S823
【目錄】：

• 摘要12-13
• ABSTRACT13-14
• 第一章 引言14-29
• 1 CMYA1基因的研究進(jìn)展14-16
• 2 DGAT1基因的研究進(jìn)展16-18
• 3 本試驗采用的技術(shù)18-27
• 3.1 啟動子克隆18-21
• 3.2 定量PCR技術(shù)21-22
• 3.3 載體構(gòu)建技術(shù)22-25
• 3.4 細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染25-27
• 3.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)25-26
• 3.4.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染26-27
• 4 顯微注射的研究進(jìn)展27-28
• 5 本研究的目的與意義28-29
• 第二章 CMYA1基因核心啟動子在牛肌肉細(xì)胞中的特異性表達(dá)29-34
• 1 材料29
• 1.1 細(xì)胞和菌液29
• 1.2 主要試劑和耗材29
• 1.3 主要儀器29
• 2 方法29-32
• 2.1 配置LB的液體培養(yǎng)基29
• 2.2 質(zhì)粒的提取29-30
• 2.3 細(xì)胞培養(yǎng)30-31
• 2.3.1 細(xì)胞的復(fù)蘇30-31
• 2.3.2 細(xì)胞的傳代31
• 2.3.3 細(xì)胞的凍存31
• 2.4 XE載體轉(zhuǎn)染牛的肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞31-32
• 3 結(jié)果與分析32-33
• 3.1 牛肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染32
• 3.2 牛成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染32-33
• 4 討論33-34
• 第三章 牛CMYA1基因核心啟動子高表達(dá)載體的構(gòu)建及驗證34-43
• 1 材料34
• 1.1 工具酶和試劑34
• 1.2 儀器設(shè)備34
• 1.3 測序和引物合成34
• 2 方法34-38
• 2.1 載體構(gòu)建34-35
• 2.1.1 PCR反應(yīng)34-35
• 2.1.2 質(zhì)粒的酶切35
• 2.1.3 凝膠回收35
• 2.2 配置LB的固體培養(yǎng)基35-36
• 2.3 載體的連接36
• 2.4 載體的轉(zhuǎn)化36-37
• 2.4.1 感受態(tài)的制備36
• 2.4.2 轉(zhuǎn)化36-37
• 2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染37
• 2.6 細(xì)胞cDNA的獲取37
• 2.6.1RNA抽提37
• 2.6.2 反轉(zhuǎn)錄37
• 2.7 PCR以及RT-PCR檢測37-38
• 3 結(jié)果和分析38-41
• 3.1 載體構(gòu)建38-39
• 3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染39-40
• 3.3 定量PCR40-41
• 4 討論41-43
• 第四章 小鼠受精卵發(fā)育中XD載體的影響43-49
• 1 材料43
• 1.1 儀器和耗材43
• 1.2 試劑43
• 2 方法43-46
• 2.1 移卵針、持卵針、注射針的制備43-44
• 2.1.1 移卵針的拉制43
• 2.1.2 持卵針的拉制43
• 2.1.3 注射針的拉制43-44
• 2.2 試驗動物選擇44
• 2.3 雌性小鼠的超數(shù)排卵44
• 2.4 受精卵的采集及體外培養(yǎng)44
• 2.5 顯微操作44-46
• 2.5.1 注射針的準(zhǔn)備44-45
• 2.5.2 顯微操作系統(tǒng)的準(zhǔn)備45
• 2.5.3 顯微注射45-46
• 3 結(jié)果和分析46-48
• 3.1 小鼠受精卵的收集46
• 3.2 XD載體濃度對小鼠受精卵發(fā)育的影響46-47
• 3.3 原和注射對小鼠受精卵發(fā)育的影響47-48
• 4 討論48-49
• 第五章 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-56
• 致謝56-57
• 附錄57-59
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文59

【相似文獻(xiàn)】

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1 翟紅林;;基于化學(xué)特征的大腸桿菌核心啟動子分析與預(yù)測[A];第十一屆全國計算（機(jī)）化學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2011年

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3 王曉慧;大腸桿菌核心啟動子的化學(xué)特性分析[D];蘭州大學(xué);2008年

4 侯建偉;PD-1核心啟動子的定位及活性檢測[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2010年

5 姚茂金;STK11基因核心啟動子轉(zhuǎn)錄活性、順式作用元件的鑒定及P53對STK11正反饋調(diào)節(jié)作用的研究[D];中南大學(xué);2007年

6 吳冬梅;STGC3基因核心啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的鑒定[D];南華大學(xué);2014年

7 阮楠;豬和小鼠生長激素核心啟動子的鑒定及調(diào)控差異的研究[D];吉林大學(xué);2012年

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本文編號：286268