本文關(guān)鍵詞：禽腦脊髓炎病毒咸陽株的分離鑒定及其在雛雞體內(nèi)的組織分布研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：禽腦脊髓炎(avian encephalomyelitis,AE)是由禽腦脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)引起的,以幼禽頭頸部快速震顫和共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)癥狀為主要特征的接觸性傳染病,成年雞為亞臨床癥狀,表現(xiàn)為一過性產(chǎn)蛋下降和種蛋孵化率降低。AEV是單股正鏈RNA病毒,屬于小RNA病毒科,震顫病毒屬成員。該病自1932年首次在美國發(fā)現(xiàn)以來,已經(jīng)傳播至全球多個(gè)國家和地區(qū),給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前該病尚未有特定的治療方法,只能依靠疫苗免疫進(jìn)行預(yù)防控制。因此,研究AEV在雛雞體內(nèi)的組織分布對(duì)于AEV的致病機(jī)制研究有著重要意義。本研究對(duì)AEV咸陽株進(jìn)行了分離鑒定,并運(yùn)用熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)方法測(cè)定了AEV XY13感染雛雞后病毒在雛雞體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布,獲得以下結(jié)果:1.采集咸陽市某雞場(chǎng)疑似AE感染雛雞的腦組織進(jìn)行病原的分離鑒定,經(jīng)SPF雞胚傳代、免疫組織化學(xué)試驗(yàn)和動(dòng)物回歸試驗(yàn),初步鑒定分離毒為禽腦脊髓炎病毒,并命名為AEV XY13。根據(jù)AEV 1143株VP1基因高度保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增,克隆至pMD19-T載體,轉(zhuǎn)化DH 5α感受態(tài)細(xì)胞,然后進(jìn)行序列測(cè)定,并與已知參考毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明,擴(kuò)增的VP1目的片段長度為288 bp,編碼96個(gè)氨基酸殘基;AEV XY13與參考毒株的核苷酸同源性為74.6%~99.7%,氨基酸同源性為76.0%~97.9%;遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明,AEV XY13與SX株處于相同的分支;與1143、YL、L2Z株則同處于一個(gè)較大的分支上,親緣關(guān)系較近,而與Van Roekel、NH-937和204C株則處于不同的分支上,親緣關(guān)系較遠(yuǎn);遺傳進(jìn)化距離估算結(jié)果表明,AEV XY13與1143、L2Z、SX和YL株的進(jìn)化距離均小于0.011,而與NH-937、Van Roekel和204C株的進(jìn)化距離則大于0.060。2.用熒光定量PCR測(cè)定AEV在雛雞體內(nèi)不同組織的病毒載量。將AEV病毒液以10倍梯度逐級(jí)遞減稀釋至10-7,卵黃囊接種6日齡SPF雞胚,12天后收胚,觀察并記錄每個(gè)稀釋度的雞胚病變情況,計(jì)算病毒EID50。55只1日齡SPF雛雞隨機(jī)分成兩組,試驗(yàn)組33只雛雞每只口服接種105EID50病毒液,對(duì)照組22只雛雞每只口服接種等量的PBS,觀察并記錄雛雞生長狀況。在接種后第2天、第4天、第6天、第7天、第8天、第10天、第12天、第15天、第18天、第22天和第24天隨機(jī)選取試驗(yàn)組3只雛雞和對(duì)照組2只雛雞處死,采集腦、肝、腸、腺胃、法氏囊、脾和腎等組織器官,運(yùn)用熒光定量PCR方法測(cè)定各器官內(nèi)的病毒載量。結(jié)果表明,試驗(yàn)組雛雞在攻毒后第6天,5只雛雞開始出現(xiàn)AE臨床癥狀,1只在發(fā)病后第2天死亡,攻毒后10天,發(fā)病雛雞的神經(jīng)癥狀逐步消失并恢復(fù)正常。病毒載量檢測(cè)結(jié)果顯示,病毒感染第2天就能在腦、肝臟、腸道、腺胃、法氏囊、脾和腎等被檢器官中檢測(cè)到病毒,且腦組織中的病毒載量最低;感染后6天,腦組織中病毒載量達(dá)到峰值,此時(shí)試驗(yàn)組部分雛雞開始出現(xiàn)AE臨床癥狀;腸道、腺胃等消化器官中的病毒載量在整個(gè)試驗(yàn)階段基本保持平穩(wěn),而肝臟在感染前期逐步下降后到后期有所回升,表明AEV對(duì)胃腸道等消化器官具有較強(qiáng)的組織嗜性;法氏囊和脾臟等免疫器官中的病毒載量呈波動(dòng)狀態(tài);腎臟中的病毒載量逐步下降。3.免疫組織化學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)病毒感染雛雞第2天、第7天和第12天,腦、肝臟、腸道、腺胃、法氏囊、脾臟和腎臟等組織中病毒抗原在各器官中的定位,估算各組織中病毒抗原相對(duì)表達(dá)量,并分析第2天、第7天和第12天各組織中病毒載量與病毒蛋白相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性。結(jié)果顯示,在病毒感染第2天、第7天和第12天各組織器官中均有大量的棕黃色陽性著色,表明在相應(yīng)的組織中均有大量病毒定殖。相關(guān)性分析結(jié)果表明,病毒感染第2天、第7天和第12天各組織中的病毒蛋白相對(duì)表達(dá)量與病毒載量呈正相關(guān)。綜上所述,AEV XY13株與SX、YL、1143和L2Z株的親緣關(guān)系最近,而與NH-937、Van Roekel和204C株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),表明AEV XY13株與參考毒株相比,在遺傳進(jìn)化關(guān)系上存在一定的差異。組織器官中病毒載量測(cè)定結(jié)果表明,AEV對(duì)胃腸道等消化器官的組織嗜性較強(qiáng),而對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)等器官的嗜性則較弱。相關(guān)性分析結(jié)果表明,各器官中病毒蛋白相對(duì)表達(dá)量與病毒載量呈正相關(guān),病毒載量與病毒蛋白抗原表達(dá)量呈對(duì)應(yīng)關(guān)系,可以準(zhǔn)確反映病毒的組織分布,為病毒的致病機(jī)理研究提供依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：禽腦脊髓炎病毒 遺傳進(jìn)化 熒光定量PCR 病毒載量 免疫組織化學(xué) 病毒抗原
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-8
• abstract8-14
• 文獻(xiàn)綜述14-24
• 第一章 禽腦脊髓炎研究進(jìn)展14-24
• 1.1 禽腦脊髓炎病毒研究進(jìn)展14-20
• 1.1.1 AEV的生物學(xué)特征14-15
• 1.1.2 AEV的增殖15
• 1.1.3 AEV基因組15-16
• 1.1.4 AEV VP1基因及其編碼的蛋白16
• 1.1.5 AEV的分類16-17
• 1.1.6 AEV檢測(cè)方法17-18
• 1.1.7 AE流行病學(xué)18
• 1.1.8 AE的臨床診斷18
• 1.1.9 AE與其他疾病的鑒別診斷18-20
• 1.1.10 AE的預(yù)防控制20
• 1.2 禽腦脊髓炎病毒在動(dòng)物體內(nèi)的分布研究20-24
• 1.2.1 AEV的致病性研究20-21
• 1.2.2 AEV的分布研究21-22
• 1.2.3 熒光定量PCR在病原體檢測(cè)中的應(yīng)用22-24
• 試驗(yàn)研究24-49
• 第二章 禽腦脊髓炎病毒咸陽株的分離鑒定及遺傳進(jìn)化分析24-35
• 2.1 材料24-26
• 2.1.1 病料采集24
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及血清24
• 2.1.3 試劑24-25
• 2.1.4 引物合成25
• 2.1.5 AEV參考毒株25
• 2.1.6 主要試劑與培養(yǎng)基的配制25
• 2.1.7 主要儀器25-26
• 2.2 方法26-30
• 2.2.1 病毒增殖26
• 2.2.2 免疫組織化學(xué)試驗(yàn)26
• 2.2.3 動(dòng)物回歸試驗(yàn)26
• 2.2.4 病毒基因的RT-PCR擴(kuò)增26-28
• 2.2.5 目的基因的克隆28-30
• 2.3 結(jié)果30-33
• 2.3.1 雞胚病理變化30
• 2.3.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果30
• 2.3.3 動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果30-31
• 2.3.4 PCR擴(kuò)增結(jié)果31
• 2.3.5 重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果31
• 2.3.6 AEV XY13 VP1片段的序列測(cè)定31
• 2.3.7 AEV XY13 VP1基因的同源性分析31-32
• 2.3.8 AEV XY13 VP1基因的遺傳進(jìn)化分析32
• 2.3.9 遺傳進(jìn)化距離比較32-33
• 2.4 討論33-34
• 2.5 小結(jié)34-35
• 第三章 禽腦脊髓炎病毒在雛雞體內(nèi)不同組織病毒載量的測(cè)定35-41
• 3.1 材料35-36
• 3.1.1 病毒35
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物35
• 3.1.3 主要試劑35
• 3.1.4 引物35
• 3.1.5 主要儀器35-36
• 3.2 方法36-37
• 3.2.1 病毒的增殖36
• 3.2.2 EID50的測(cè)定36
• 3.2.3 病料采集36
• 3.2.4 病毒RNA的提取36
• 3.2.5 cDNA合成36-37
• 3.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR37
• 3.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析37
• 3.3 結(jié)果37-39
• 3.3.1 EID50測(cè)定結(jié)果37
• 3.3.2 雛雞臨床觀察37
• 3.3.3 RNA純度測(cè)定37-38
• 3.3.4 AEV在雛雞體內(nèi)的病毒載量測(cè)定結(jié)果38-39
• 3.4 討論39-40
• 3.5 小結(jié)40-41
• 第四章 禽腦脊髓炎病毒在雛雞體內(nèi)不同組織分布研究41-49
• 4.1 材料41-42
• 4.1.1 病毒41
• 4.1.2 血清41
• 4.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物41
• 4.1.4 主要試劑41
• 4.1.5 主要溶液配制41-42
• 4.1.5 主要試驗(yàn)儀器42
• 4.2 方法42-44
• 4.2.1 病料采集42
• 4.2.2 載玻片處理42
• 4.2.3 石蠟切片的制作42-43
• 4.2.4 免疫組織化學(xué)染色43-44
• 4.2.5 病毒蛋白相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算44
• 4.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析44
• 4.3 結(jié)果44-47
• 4.3.1 一抗最佳稀釋度的確定44
• 4.3.2 DAB顯色時(shí)間的確定44
• 4.3.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果44-46
• 4.3.4 病毒蛋白相對(duì)表達(dá)量計(jì)算結(jié)果46-47
• 4.4 討論47-48
• 4.5 小結(jié)48-49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-56
• 縮略詞表56-57
• 致謝57-58
• 作者簡介58

【相似文獻(xiàn)】

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