本文關(guān)鍵詞：Sirt1通過PI3K-Akt-mTOR信號(hào)途徑對(duì)鵝肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)代謝平衡被破壞,就會(huì)引起大量的的脂質(zhì)在肝臟內(nèi)沉積形成脂肪肝。Sirtl基因在脂質(zhì)代謝中起著重要的調(diào)控作用,但其具體調(diào)控機(jī)制還不明確；PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路參與調(diào)控糖脂代謝等新陳代謝活動(dòng),而其具體機(jī)理也是目前的研究熱點(diǎn)之一；兩者在脂質(zhì)調(diào)控中是否存在相互作用,目前鮮見報(bào)道,因此本試驗(yàn)通過不同濃度的尼克酰胺(Nicotinamide)處理鵝原代肝細(xì)胞,檢測(cè)Sirt1和脂質(zhì)代謝關(guān)鍵因子的表達(dá)變化；然后在選出的最佳尼克酰胺濃度處理鵝原代肝細(xì)胞的基礎(chǔ)上,添加不同的PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路抑制劑LY294002、NVP-BEZ235、雷帕霉素(Rapamycin)處理培養(yǎng),檢測(cè)脂肪酸合成與氧化、VLDL的生成和分泌、PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵因子和Sirt1本身的表達(dá)變化,分析Sirt1通過PI3K-Akt-mTOR信號(hào)途徑調(diào)控脂質(zhì)代謝的機(jī)理。主要研究結(jié)果如下：1.不同濃度尼克酰胺處理鵝原代肝細(xì)胞,Sirtl的mRNA表達(dá)水平和蛋白濃度隨著尼克酰胺濃度升高而降低；尼克酰胺處理濃度為100μmol/L時(shí),Sirt1蛋白濃度為對(duì)照組的51.50%;2.不同濃度尼克酰胺處理肝細(xì)胞,促進(jìn)脂肪酸合成關(guān)鍵因子SREBP1、FAS、ACCa表達(dá)(P0.05),抑制脂肪酸氧化關(guān)鍵因子PPARα、PPARγ、ACOX1、CPT1的表達(dá)(P0.05),下調(diào)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵因子FoxO1、MTTP、DGAT1、DGAT2的表達(dá)水平(P0.05)；尼克酰胺處理也能增加胞內(nèi)TG含量(P0.05),減少VLDL和胞外TG含量(P0.05),誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)脂滴增大增多、脂質(zhì)含量上升(P0.05),脂質(zhì)沉積增加;3.鵝肝細(xì)胞添加100μmol/L的尼克酰胺處理后,PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵因子P13K的表達(dá)被抑制(P0.05), mTOR表達(dá)被上調(diào)(P0.05), Akt1表達(dá)無顯著性變化(P0.05)；再添加通路抑制劑LY294002時(shí),mTOR、Akt1表達(dá)被下調(diào),PI3K表達(dá)與尼克酰胺單獨(dú)處理無顯著性差異；而當(dāng)再添加通路抑制劑Rapamycin時(shí),mTOR、Akt表達(dá)降低,而PI3K表達(dá)較尼克酰胺單獨(dú)處理顯著升高；當(dāng)在添加NVP-BEZ235雙重抑制信號(hào)通路時(shí),Akt表達(dá)與對(duì)照組無顯著性差異,mTOR被下調(diào),PI3K表達(dá)較尼克酰胺單獨(dú)處理無顯著性差異。再添加NVP-BEZ235抑制劑時(shí),Sirt1表達(dá)與尼克酰胺單獨(dú)處理無顯著性差異,而當(dāng)再添加另外兩種通路抑制劑時(shí),Sirtl表達(dá)顯著降低(P0.05)；4.最佳濃度100μmol/L的尼克酰胺處理鵝肝細(xì)胞,抑制Sirtl表達(dá),導(dǎo)致脂肪酸合成關(guān)鍵因子表達(dá)增加；而添加通路抑制劑LY29002、NVP-BEZ235、Rapamycin時(shí),脂肪酸合成關(guān)鍵因子表達(dá)被顯著下調(diào)(P0.05),而且NVP-BEZ235的效果最強(qiáng)；5.通路抑制劑LY294002、NVP-BEZ235和尼克酰胺共處理鵝肝細(xì)胞,能減弱尼克酰胺單獨(dú)處理對(duì)脂肪酸氧化關(guān)鍵因子的抑制效果,而且添加NVP-BEZ235的這種減弱效果更強(qiáng)；但是脂肪酸氧化關(guān)鍵因子CPTl蛋白表達(dá)上卻是添加LY294002時(shí)最高(P0.05)；6.脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵因子能被尼克酰胺所抑制,當(dāng)再添加抑制劑LY294002、 NVP-BEZ235和Rapamycin時(shí),脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵因子表達(dá)被進(jìn)一步下調(diào)；但是,DGAT1的mRNA表達(dá)水平在添加LY294002時(shí)被顯著上調(diào)了(P0.05)；同樣FoxO1的mRNA表達(dá)水平和蛋白濃度在添加NVP-BEZ235處理時(shí)顯著升高(P0.05);7.100μmol/L的尼克酰胺能顯著提高肝細(xì)胞活性,增加肝細(xì)胞內(nèi)TG等脂質(zhì)的含量,減少VLDL的生成分泌和胞外TG含量；當(dāng)添加通路抑制劑LY294002、NVP-BEZ235時(shí),細(xì)胞活性變化不大,肝細(xì)胞內(nèi)TG等脂質(zhì)含量顯著降低(P0.05),VLDL和胞外TG含量高于尼克酰胺單獨(dú)處理組；而添加通路抑制劑Rapamycin時(shí), VLDL和胞外TG含量最低：油紅O染色發(fā)現(xiàn),添加通路抑制劑之后,肝細(xì)胞內(nèi)脂滴減少變小,脂質(zhì)含量降低(P0.05),肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積作用減弱；
【關(guān)鍵詞】：Sirt1 尼克酰胺 PI3K-Akt-mTOR 脂質(zhì)代謝
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S835
【目錄】：

• 摘要5-7
• Summary7-10
• 符號(hào)說明10-13
• 1 文獻(xiàn)綜述13-17
• 1.1 Sirt1基因概述13-14
• 1.2 Sirt1與脂質(zhì)代謝14-15
• 1.3 Sirt1與PI3K-Akt-mTOR信號(hào)途徑的相互作用15-16
• 1.4 本研究的目的和意義16-17
• 2 材料和方法17-30
• 2.1 材料17-20
• 2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物材料17
• 2.1.2 試驗(yàn)主要儀器17-18
• 2.1.3 試驗(yàn)主要藥品18-19
• 2.1.4 試驗(yàn)主要試劑盒19
• 2.1.5 試驗(yàn)主要藥品的配制19-20
• 2.2 方法20-30
• 2.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)20-21
• 2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)21-22
• 2.2.3 總RNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)22-23
• 2.2.4 反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA23-24
• 2.2.5 定量引物設(shè)計(jì)及合成24-25
• 2.2.6 熒光定量PCR25-26
• 2.2.7 CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性26-27
• 2.2.8 油紅O染色檢測(cè)脂質(zhì)含量27
• 2.2.9 總蛋白的獲取及濃度測(cè)定27-28
• 2.2.10 目的蛋白濃度檢測(cè)28-29
• 2.2.11 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)29-30
• 2.2.12 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析30
• 3 結(jié)果及分析30-52
• 3.1 Sirt1抑制劑尼克酰胺對(duì)鵝肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響30-40
• 3.1.1 尼克酰胺最佳抑制濃度的篩選30
• 3.1.2 Sirt1抑制劑尼克酰胺對(duì)鵝肝細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)外脂質(zhì)含量的影響30-34
• 3.1.3 尼克酰胺對(duì)脂肪酸合成、脂肪酸氧化及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑關(guān)鍵因子的影響34-40
• 3.2 Sirt1對(duì)PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路活性的影響40-42
• 3.3 Sirt1通過PI3K-Akt-mTOR信號(hào)途徑對(duì)脂質(zhì)代謝的影響42-52
• 3.3.1 Sirt1通過PI3K-Akt-mTOR信號(hào)途徑對(duì)細(xì)胞內(nèi)外脂質(zhì)含量的影響42-46
• 3.3.2 Sirt1通過PI3K-Akt-mTOR信號(hào)途徑對(duì)脂肪酸合成、脂肪酸氧化及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑關(guān)鍵因子的影響46-52
• 4 討論52-60
• 4.1 Sirt1在脂質(zhì)沉積中的調(diào)控作用52-54
• 4.2 Sirt1對(duì)PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路的調(diào)控作用54-56
• 4.3 Sirt1通過PI3K-Akt-mTOR信號(hào)途徑對(duì)脂質(zhì)代謝的調(diào)控作用56-60
• 4.3.1 Sirt1通過PI3K-Akt-mTOR信號(hào)途徑調(diào)控脂質(zhì)合成和氧化56-58
• 4.3.2 Sirt1通過PI3K-Akt-mTOR信號(hào)途徑對(duì)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控58-60
• 5 結(jié)論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-69
• 致謝69-70
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄70

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  本文關(guān)鍵詞：Sirt1通過PI3K-Akt-mTOR信號(hào)途徑對(duì)鵝肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：283253