本文關(guān)鍵詞：miR-127靶向抑制ACO2基因表達(dá)及其通路研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬骨骼肌肌纖維類型和結(jié)構(gòu)特征是影響豬肉品質(zhì)的一個(gè)關(guān)鍵因素。本研究結(jié)合課題組前期高通量測序的結(jié)果和數(shù)據(jù)分析,以可能調(diào)控肌纖維類型的miR-127為研究對(duì)象,旨在闡述miR-127靶向基因及其調(diào)控通路。本試驗(yàn)以60頭閹割杜×(長×大)豬(DLY)63d、98d和161d背最長肌為試驗(yàn)樣品,通過制作石蠟切片和HE染色測定不同發(fā)育階段其肌纖維類型比例。后又以1日齡DLY仔豬為試驗(yàn)對(duì)象,分離出原代豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞,轉(zhuǎn)染miR-127mimics/inhibitor,運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(SYBR Green I)方法測定骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中ACO2、SETD8、MEF2、MAPK1、MAPK3、MAPK4和MYH7等肌纖維發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)量,同步采用Western blot的方法測定骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中MYH7蛋白的表達(dá)量。配制無賴氨酸的細(xì)胞培養(yǎng)基,培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞24h后收集細(xì)胞,測定MEF2和MYH7基因表達(dá)量。最后通過構(gòu)建載體,將正常序列ACO2-TargetN和突變序列ACO2-TargetM分別連接到含有螢光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒,試驗(yàn)組與miR-127的mimics共轉(zhuǎn)染進(jìn)293A細(xì)胞,對(duì)照組與陰性對(duì)照NC共轉(zhuǎn)染進(jìn)293A細(xì)胞,結(jié)合螢光素酶活性檢測來驗(yàn)證miR-127與ACO2之間的靶位關(guān)系。結(jié)果表明:1.隨著豬日齡的增加,Ⅱa型紅肌纖維所占比重逐步減少,63d齡所占比重顯著高于98d和161d齡(P0.05),98d和161d齡之間所占比重差異不顯著(P0.05);隨著豬日齡的增加,Ⅱx+Ⅱb型白肌纖維所占比重逐步增多,63d齡所占比重顯著低于98d和161d齡(P0.05),98d和161d齡之間所占比重差異不顯著(P0.05)。2.骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-127的模擬物mimics之后,細(xì)胞中慢肌纖維MYH7基因和蛋白表達(dá)量顯著下降(P0.05),ACO2、MEF2和MAPK3基因表達(dá)量顯著下降(P0.05),對(duì)SETD8、MAPK4和MAPK1的基因表達(dá)無顯著影響(P0.05);而轉(zhuǎn)染miR-127的抑制劑inhibitor之后,細(xì)胞中慢肌纖維MYH7基因表達(dá)量無顯著變化(P0.05)、但蛋白表達(dá)量顯著上升(P0.05),ACO2和MEF2的基因表達(dá)顯著上升(P0.05),對(duì)SETD8、MAPK4、MAPK3和MAPK1的基因表達(dá)無顯著影響(P0.05)。3.無賴氨酸培養(yǎng)基培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞試驗(yàn)中,在缺乏賴氨酸的條件下,骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中MEF2基因表達(dá)顯著下降(P0.05),MYH7基因表達(dá)也表現(xiàn)出下降趨勢,但差異不明顯(P0.05)。4.miR-127的mimics能使pmirGLO-ACO2-TargetN質(zhì)粒螢火蟲熒光素酶活性降低38.3%(P0.05),而miR-127的mimics與pmirGLO-ACO2-TargetM共轉(zhuǎn)染時(shí)對(duì)其螢火蟲熒光素酶活性無顯著影響(P0.05)。綜上所述,miR-127通過靶向抑制ACO2基因表達(dá),降低細(xì)胞內(nèi)賴氨酸含量,進(jìn)而抑制MEF2和MYH7基因表達(dá),而MYH7又是慢肌纖維的特征性基因,因此miR-127參與了肌纖維類型的調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：杜×(長×大)三元雜交豬 miR-127 肌纖維類型 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞 靶基因
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S828
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 英文縮略詞表7-11
• 1 前言11-13
• 2 材料與方法13-32
• 2.1 主要儀器設(shè)備及耗材13
• 2.2 主要試劑13-15
• 2.3 肌纖維分型測定15-17
• 2.3.1 主要試劑配制15-16
• 2.3.2 切片樣品處理16
• 2.3.3 切片制作步驟16-17
• 2.4 豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定17-19
• 2.4.1 豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離17-18
• 2.4.2 豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的傳代18
• 2.4.4 豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的鑒定18-19
• 2.5 豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞轉(zhuǎn)染19
• 2.6 賴氨酸缺失培養(yǎng)基培養(yǎng)豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞19
• 2.7 肌纖維發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)測定19-23
• 2.7.1 引物設(shè)計(jì)及合成19-20
• 2.7.2 總RNA提取及純化20-21
• 2.7.3 反轉(zhuǎn)錄及cDNA鑒定21-23
• 2.7.4 目的基因mRNA表達(dá)豐度檢測23
• 2.8 Western blot23-26
• 2.9 ACO2-TargetN和ACO2-TargetM載體構(gòu)建26-31
• 2.9.1 ACO2-TargetN正常序列的獲取26-27
• 2.9.2 PCR擴(kuò)增片段膠回收27
• 2.9.3 目的片段與T載體的連接與轉(zhuǎn)化27-28
• 2.9.4 ACO2-TargetM載體構(gòu)建28-29
• 2.9.5 目的片段與T載體的雙酶切反應(yīng)29
• 2.9.6 目的片段與線性化表達(dá)載體pmirGLO的連接29-30
• 2.9.7 pmirGLO-ACO2-Target重組質(zhì)粒的提取30-31
• 2.10 miRNA與熒光素酶報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染 293A細(xì)胞31
• 2.11 熒光素酶檢測31-32
• 2.12 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法32
• 3 結(jié)果與分析32-42
• 3.1 不同階段背最長肌肌纖維類型變化規(guī)律32-33
• 3.2 豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離、純化及鑒定33-34
• 3.3 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增值曲線34-35
• 3.4 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-127后對(duì)MYH7基因和蛋白表達(dá)的影響35-36
• 3.5 miR-127調(diào)控肌纖維類型途徑的確定36-39
• 3.5.1 轉(zhuǎn)染miR-127對(duì)肌纖維發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響37-38
• 3.5.2 賴氨酸缺失培養(yǎng)基MEF2和MYH7基因表達(dá)的影響38-39
• 3.7 pmirGLO-ACO2表達(dá)載體的構(gòu)建39-40
• 3.8 miR-127靶向ACO2的驗(yàn)證40-42
• 4 討論42-47
• 4.1 日齡對(duì)肌纖維類型的影響42-44
• 4.2 miRNAs對(duì)骨骼肌發(fā)育相關(guān)通路的影響44-45
• 4.3 miR-127靶向抑制ACO2基因及其作用通路45-47
• 5 結(jié)論47-48
• 致謝48-49
• 參考文獻(xiàn)49-52

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 YANG Ya-lan;LI Yan;LIANG Ru-yi;ZHOU Rong;AO Hong;MU Yu-lian;YANG Shu-lin;LI Kui;TANG Zhong-lin;;Dynamic Expression of MicroRNA-127 During Porcine Prenatal and Postnatal Skeletal Muscle Development[J];Journal of Integrative Agriculture;2014年06期

2 谷英;孫海洲;桑丹;李勝利;張春華;凌樹禮;珊丹;任曉萍;石巖;;肉品質(zhì)評(píng)定指標(biāo)及影響因素的研究進(jìn)展[J];中國畜牧獸醫(yī);2013年07期

3 陳瓊;王濟(jì)民;;我國肉類消費(fèi)現(xiàn)狀與未來發(fā)展趨勢[J];中國食物與營養(yǎng);2013年06期

4 任列嬌;趙素梅;胡洪;郭雷;高士爭;;肌纖維類型及其對(duì)豬肉品質(zhì)影響的研究進(jìn)展[J];云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2010年01期

5 高儒松;程志斌;楊正華;;肌纖維類型與豬肉品質(zhì)的關(guān)系[J];中國畜牧獸醫(yī);2009年04期

6 黃稚淳,梁細(xì)云;影響禽肉品質(zhì)的因素[J];肉類工業(yè);2005年06期

  本文關(guān)鍵詞：miR-127靶向抑制ACO2基因表達(dá)及其通路研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：277816