本文關(guān)鍵詞：牦牛脂肪分化相關(guān)miRNAs的篩選、表達(dá)及其靶基因分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：牦牛主要分布在青藏高原及其毗鄰的高海拔區(qū)域,是當(dāng)?shù)啬撩竦闹饕馐硜?lái)源。特殊的環(huán)境和飼養(yǎng)方式形成了獨(dú)特的肉品質(zhì),也造成了牦牛夏壯、春乏的生長(zhǎng)規(guī)律,而脂肪分化對(duì)于脂肪的形成具有重要影響,脂肪細(xì)胞分化進(jìn)程由多個(gè)信號(hào)通路參與復(fù)雜生物過(guò)程,miRNA對(duì)于脂肪分化也有不同程度的調(diào)節(jié),但具體的調(diào)控機(jī)制至今尚不明確。為更好的解析牦牛脂肪分化的調(diào)控機(jī)制,本論文運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)出牦牛脂肪分化相關(guān)候選miRNAs,并分析候選miRNAs的組織間表達(dá)差異,運(yùn)用TargetScan和STRING在線(xiàn)軟件篩選出候選miRNAs的相應(yīng)靶基因并對(duì)其進(jìn)行功能分析,采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)得到的候選靶基因進(jìn)行驗(yàn)證,主要結(jié)果如下：1.牦牛脂肪分化相關(guān)miRNAs的篩選首先找出可能調(diào)控普通牛脂肪分化的miRNAs,將其同牦牛核苷酸序列進(jìn)行blast比對(duì),運(yùn)用Mfold預(yù)測(cè)所得pre-miRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu),得到bta-miR-2340、 bta-miR-1260b、bta-miR-22-5p、bta-miR-2328-3p、bta-miR-1777b和bta-miR-1388-5p共5個(gè)miRNAs可能參與牦牛脂肪分化調(diào)控。2.候選miRNAs組織間差異表達(dá)分析對(duì)預(yù)測(cè)得到的5個(gè)miRNAs基于心、脾、肺、腎、背最長(zhǎng)肌和皮下脂肪6個(gè)組織進(jìn)行表達(dá)差異分析。結(jié)果顯示,脂肪組織,肝臟組織和胰臟組織作為脂質(zhì)代謝的主要組織,bta-miR-2328-3p、bta-miR-1388-5p和bta-miR-22-5p相較其他組織在脂肪組織中表達(dá)量均較低,可能主要參與其他調(diào)節(jié)并非調(diào)控脂肪分化；而bta-miR-2340、bta-miR-1777b和bta-miR-1260b在脂肪組織中表達(dá)量相對(duì)較高,可能參與調(diào)控脂肪分化過(guò)程。3.候選miRNAs靶基因的預(yù)測(cè)和功能分析運(yùn)用TargetScan對(duì)篩選得到的miRNA包括bta-miR-2340、bta-miR-1777b和bta-miR-1260b進(jìn)行相應(yīng)靶基因的預(yù)測(cè)。bta-miR-2340和bta-miR-1777b分別預(yù)測(cè)得到131和49個(gè)靶基因,而bta-miR-1260b無(wú)預(yù)測(cè)結(jié)果。使用STRING在線(xiàn)軟件對(duì)bta-miR-2340靶基因進(jìn)行功能分析,候選靶基因BAD、CHRM1、IRAK1、 SOCS3和FOXO4主要參與脂肪分化相關(guān)信號(hào)通路,推測(cè)上述基因可能為bta-miR-2340的靶基因。4. bta-miR-2340候選靶基因的組織間差異表達(dá)分析運(yùn)用RT-PCR對(duì)bta-miR-2340候選靶基因進(jìn)行心、脾、肺、腎、背最長(zhǎng)肌和皮下脂肪組織的表達(dá)差異分析,結(jié)果顯示BAD和IRAK1整體表達(dá)量較高。其中BAD在心中高豐度表達(dá),脂肪中次之。CHRM1同在脂肪中相比腎中表達(dá)量較高。IRAKI在心和脾中表達(dá)量高,其他組織較低。SOCS3在肺和脂肪中表達(dá)量較高。FOXO4心和背肌組織中表達(dá)量較高,其他組織均較低。但CHRM1和FOXO4整體表達(dá)均很低。5. bta-miR-2340靶基因的驗(yàn)證采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)bta-miR-2340靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。分別構(gòu)建BAD、CHRM1、IRAK1、SOCS3和FOXO4與psiCHECK-2載體的重組質(zhì)粒,并在bta-miR-2340 mimics和脂質(zhì)體2000存在的條件下轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞。與對(duì)照組相比最終結(jié)果顯示bta-miR-2340 mimics可降低BAD突變型活性,對(duì)于CHRM1、IRAK1、SOCS3和FOXO4突變型均無(wú)任何影響,對(duì)于CHRM1野生型也無(wú)任何影響,然而可增加IRAKI和FOXO4野生型熒光活性,只有SOCS3野生型熒光活性下降且突變組熒光活性無(wú)影響,但只下降20%不符合前人所述30%,推測(cè)bta-miR-2340可能均不作用于以上位點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：牦牛 脂肪分化 miRNAs 靶基因 差異表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：西北民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S823.85
【目錄】：

• 摘要5-7
• abstract7-9
• 縮略詞表9-13
• 第1章 文獻(xiàn)綜述13-27
• 1.1 脂肪細(xì)胞分化概述13-22
• 1.1.1 脂肪細(xì)胞分化過(guò)程13
• 1.1.2 脂肪組織分類(lèi)13-14
• 1.1.3 調(diào)控脂肪分化的主要信號(hào)通路14-17
• 1.1.3.1 Wnt/β-catenin信號(hào)通路14-15
• 1.1.3.2 TGF-β信號(hào)通路15-16
• 1.1.3.3 MAPK信號(hào)通路16
• 1.1.3.4 FGF信號(hào)通路16-17
• 1.1.3.5 Hedgehog信號(hào)通路17
• 1.1.3.6 胰島素/IGF1信號(hào)通路17
• 1.1.4 調(diào)控脂肪分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子17-20
• 1.1.4.1 PPARs17-19
• 1.1.4.2 C/EBPs家族19
• 1.1.4.3 SREBP家族19-20
• 1.1.5 調(diào)控脂肪組織和肌內(nèi)脂肪代謝關(guān)鍵基因研究進(jìn)展20-22
• 1.1.5.1 LPL21
• 1.1.5.2 LRP621
• 1.1.5.3 AP221-22
• 1.1.5.4 FAS22
• 1.1.5.5 SOCS322
• 1.2 miRNA的研究進(jìn)展22-26
• 1.2.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)及形成機(jī)制22-23
• 1.2.2 動(dòng)物miRNA的作用機(jī)制23-24
• 1.2.3 miRNA的鑒定方法24-25
• 1.2.3.1 直接克隆法24
• 1.2.3.2 生物信息學(xué)法24-25
• 1.2.3.3 其他方法25
• 1.2.4 調(diào)控脂肪分化miRNA的研究進(jìn)展25-26
• 1.3 本研究的目的及意義26-27
• 第2章 牦牛脂肪分化相關(guān)miRNA的預(yù)測(cè)與表達(dá)分析27-39
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料27-28
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣品采集27
• 2.1.2 主要儀器設(shè)備27
• 2.1.3 主要試劑27
• 2.1.4 數(shù)據(jù)采集27-28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法28-31
• 2.2.1 miRNA生物信息學(xué)預(yù)測(cè)28
• 2.2.2 組織總RNA提取28-29
• 2.2.3 引物設(shè)計(jì)29
• 2.2.4 RNA反轉(zhuǎn)錄29-30
• 2.2.5 PCR分析30
• 2.2.6 RT-PCR分析30-31
• 2.3 結(jié)果和分析31-35
• 2.3.1 候選牦牛與脂肪分化相關(guān)miRNA31-34
• 2.3.2 牦牛各組織總RNA提取結(jié)果34
• 2.3.3 候選miRNA的RT-PCR分析34-35
• 2.4 討論35-38
• 2.5 小結(jié)38-39
• 第3章 牦牛miRNA靶基因的預(yù)測(cè)、功能及表達(dá)分析39-45
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料39
• 3.1.1 主要軟件39
• 3.1.2 主要儀器設(shè)備及試劑39
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法39-40
• 3.2.1 miRNA靶基因預(yù)測(cè)及功能分析39
• 3.2.2 miRNA靶基因表達(dá)引物設(shè)計(jì)39
• 3.2.3 cDNA合成及實(shí)時(shí)熒光定量PCR39-40
• 3.3 結(jié)果和分析40-43
• 3.3.1 miRNA靶基因預(yù)測(cè)和功能分析40-42
• 3.3.2 miRNA候選靶基因RT-PCR分析42-43
• 3.4 討論43-44
• 3.5 小結(jié)44-45
• 第4章 bta-miR-2340靶基因的驗(yàn)證45-53
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料45
• 4.1.1 主要試劑與儀器45
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法45-49
• 4.2.1 靶基因克隆和載體構(gòu)建引物設(shè)計(jì)45-46
• 4.2.2 靶位點(diǎn)PCR擴(kuò)增和回收46
• 4.2.3 T克隆測(cè)序46-48
• 4.2.4 雙酶切和重組載體構(gòu)建48
• 4.2.5 Hela細(xì)胞的培養(yǎng)48-49
• 4.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染49
• 4.2.7 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)49
• 4.3 結(jié)果和分析49-51
• 4.3.1 野生型和突變型質(zhì)粒構(gòu)建50
• 4.3.2 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)50-51
• 4.4 討論51-52
• 4.5 結(jié)論52-53
• 結(jié)論53
• 創(chuàng)新點(diǎn)53
• 進(jìn)一步研究?jī)?nèi)容53-54
• 參考文獻(xiàn)54-65
• 致謝65

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  本文關(guān)鍵詞：牦牛脂肪分化相關(guān)miRNAs的篩選、表達(dá)及其靶基因分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：277319