本文關(guān)鍵詞：豬病毒性腹瀉PCR檢測(cè)方法建立與流行病學(xué)調(diào)查，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：生豬養(yǎng)殖是我國畜牧產(chǎn)業(yè)的重要支柱,但隨著我國生豬養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)�；�、集約化發(fā)展,導(dǎo)致各種疾病頻發(fā),其中豬腹瀉更是制約我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要原因之一,給我養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。近年來,我國大部分地區(qū)包括貴州省的養(yǎng)豬場(chǎng)發(fā)生了不同程度的腹瀉。引起豬發(fā)生腹瀉的原因有很多,包括寄生蟲感染、細(xì)菌感染、病毒感染及飼養(yǎng)管理等因素,但以病毒感染較為常見,其中的病原主要有豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬輪狀病毒(Po RV)。為此,本文首先建立了針對(duì)豬病毒性腹瀉主要病原的PCR檢測(cè)方法,并進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查和病原分子變異分析。具體研究內(nèi)容如下:1.豬病毒性腹瀉病原PCR方法的建立:(1)三重PCR方法的建立:根據(jù)Genbank提供的PEDV S基因、TGEV M基因和Po RV VP7基因參考序列,設(shè)計(jì)三對(duì)特異性引物,以克隆的質(zhì)粒為模板,進(jìn)行PEDV、TGEV和Po RV三重PCR檢測(cè)和反應(yīng)條件的優(yōu)化。結(jié)果:PEDV、TGEV和Po RV三重PCR反應(yīng)體系最佳退火溫度為51℃,PEDV、TGEV和Po RV最適引物濃度分別為0.5μM/L、0.3μM/L和0.3μM/L,最低質(zhì)粒模板檢出量分別為1×102copies/μL、1×100opies/μL、1×103copies/μL;且該方法不能檢出豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬瘟病毒(CSFV)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV);對(duì)102份病料進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),病料中PEDV、TGEV和Po RV的檢出率分別為37.25%、1.96%和6.86%。(2)單項(xiàng)LAMP方法的建立:根據(jù)Genbank提供的PEDV M基因、TGEV N基因、Po RV VP7基因參考序列,設(shè)計(jì)6對(duì)特異性LAMP引物,以克隆的全基因重組質(zhì)粒為模板,進(jìn)行PEDV、TGEV和Po RV LAMP的檢測(cè)和反應(yīng)條件的優(yōu)化。結(jié)果:PEDV、TGEV和Po RV單項(xiàng)LAMP方法最佳反應(yīng)溫度分別為60℃、64℃和62℃,最佳反應(yīng)時(shí)間為60min、60min和90min,最佳外引物與內(nèi)引物濃度比為200 nmol/L:2400 nmol/L、200 nmol/L:2400 nmol/L和200 nmol/L:3200 nmol/L,最佳Mg2+濃度為2.5 mmol/L、1.0mmol/L和2.5mmol/L,最佳d NTP濃度0.8mmol/L、0.6mmol/L和0.6mmol/L,最佳Bst DNA聚合酶濃度為0.16U/μL、0.64U/μL和0.64U/μL,最低檢出量為1.0×102copies/μL、1.0×101copies/μL和1.0×102copies/μL,相互間無交叉反應(yīng);對(duì)12份病料檢測(cè)發(fā)現(xiàn),PEDV、TGEV和Po RV的LAMP檢測(cè)與普通PCR方法檢測(cè)的符合率分別為75%、100%和100%。2.貴州省豬病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查:(1)發(fā)病情況調(diào)查:采用實(shí)地考察及問卷調(diào)查等方法對(duì)貴州省部分規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)進(jìn)行豬腹瀉發(fā)病狀況調(diào)查、臨床癥狀與病理變化觀察,結(jié)果:2013年~2015年,在調(diào)查的13個(gè)規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)中,豬腹瀉發(fā)生率為61.07%(4368/7153),病死率為71.50%(3123/4368);仔豬腹瀉主要發(fā)生于4~21日齡,發(fā)病時(shí)間主要在冬春季節(jié);成年豬多表現(xiàn)為隱性感染;仔豬主要表現(xiàn)為水樣腹瀉,病變主要在胃腸道,組織病變表現(xiàn)為小腸絨毛脫落。(2)病原學(xué)調(diào)查:采集2013~2015年規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)豬糞便樣本221份,采用建立的三重PCR方法進(jìn)行PEDV、TGEV和Po RV病原核酸檢測(cè),結(jié)果:PEDV、TGEV和Po RV核酸檢出率分別為59.45%(131/221)、0.92%(2/221)和6.91%(15/221),且PEDV與Po RV、PEDV與TGEV的混合感染率分別為5.88%(13/221)和0.90%(2/221),不同豬群中哺乳仔豬PEDV、TGEV及Po RV的陽性率均為最高,分別為60.00%(96/160)、1.25%(2/160)及8.75%(14/160)。另外,PEDV檢出率呈逐年下降趨勢(shì)。(3)血清學(xué)調(diào)查:收集2013~2015年24個(gè)規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)275份血清樣本,采用ELISA方法進(jìn)行PEDV、TGEV和Po RV抗體檢測(cè),結(jié)果:免疫豬群中PEDV、TGEV和Po RV的血清抗體陽性率分別為43.09%(53/123)、39.02%(48/123)和42.28%(52/123);未免疫豬群中PEDV、TGEV和Po RV的血清抗體陽性率分別為30.92%(47/152),36.18%(55/152)和38.82%(59/152)。3.PEDV與Po RV分子流行病學(xué)調(diào)查:根據(jù)Gen Bank登錄的PEDV和Po RV基因序列,設(shè)計(jì)PEDV M基因、ORF3基因和Po RV VP7基因特異性引物,然后提取仔豬腹瀉臨床樣本RNA,進(jìn)行目的基因擴(kuò)增、克隆和測(cè)序,利用DNAStar和MEGA5.0軟件進(jìn)行序列分析。結(jié)果:(1)成功克隆到14株P(guān)EDV的ORF3基因,全長均為675bp,可編碼225個(gè)AA,核苷酸和氨基酸序列的同源性分別在95.1%~100%與95.1%~100%之間;與經(jīng)典毒株CV777的同源性分別在95.9%~97.2%與93.8%~96.4%之間,貴州流行株的ORF3基因核苷酸在第62、160、235、243、274、301、360、450和497位發(fā)生點(diǎn)突變,無插入或缺失;系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示,14株流行毒株與CV777株、美國毒株、越南和韓國毒株親緣關(guān)系較近,與疫苗株Attenuated DR13親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。(2)14株P(guān)EDV的M基因全長均為681bp,可編碼226個(gè)AA;核苷酸和氨基酸序列的同源性分別在98.1%~100%與98.2%~100%之間;與經(jīng)典毒株CV777的同源性分別在97.9%~99.1%與98.7%~99.1%之間,與弱毒株Attenuated DR13同源性分別在97.9%~98.1%與97.8%~98.2%之間,貴州流行株主要在第125、198、213、234、285、348和618位發(fā)生點(diǎn)突變;(3)成功克隆到4株P(guān)o RV的VP7基因,全長均981bp,可編碼326個(gè)AA,核苷酸和氨基酸序列的同源性分別在95.5%~99.7%和96.6%~99.7%之間,與國內(nèi)外參考毒株的同源性分別為71.4%~97.1%和72.1%~99.1%,與G4型參考毒株的同源性分別為87.0%~97.1%和93.3%~99.1%;系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示,4株貴州流行株與G4型毒株處于同一個(gè)群,由此推測(cè)4株P(guān)o RV貴州流行株屬于G4型Po RV。結(jié)論:1.成功建立了豬病毒性腹瀉主要病原PEDV、TGEV和Po RV三重PCR方法及單項(xiàng)LAMP檢測(cè)方法。2.貴州省規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)豬病毒性腹瀉的主要病原為PEDV;主要發(fā)生于哺乳仔豬;主要發(fā)生在冬春季節(jié),豬病毒性腹瀉疫苗的免疫效果較差。3.貴州省PEDV地方流行株與韓國毒株、越南毒株和美國毒株親緣關(guān)系近,與Attenuated DR13、Brl/87親緣關(guān)系遠(yuǎn);貴州省Po RV地方流行株主要是G4型。
【關(guān)鍵詞】：豬病毒性腹瀉 PCR檢測(cè)方法 流行病學(xué) 分子流行病學(xué)
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.28
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 英文縮略表12-13
• 文獻(xiàn)綜述13-24
• 第一章 PEDV、TGEV和Po RV PCR檢測(cè)方法建立24-60
• 1 材料25-26
• 1.1 試驗(yàn)毒株25
• 1.2 臨床樣本25
• 1.3 主要試劑25
• 1.4 主要儀器25-26
• 2 方法26-35
• 2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備26-29
• 2.2 PEDV、TGEV和PoRV三重PCR方法的建立29-33
• 2.3 PEDV、TGEV和PoRV單項(xiàng)LAMP方法的建立33-35
• 3 結(jié)果35-57
• 3.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備結(jié)果35-38
• 3.2 PEDV、TGEV和PoRV三重PCR方法建立結(jié)果38-46
• 3.3 PEDV、TGEV和PoRV單項(xiàng)LAMP方法建立結(jié)果46-57
• 4 討論57-60
• 4.1 關(guān)于豬病毒性腹瀉的主要病原57-58
• 4.2 關(guān)于PEDV、TGEV和PoRV三重PCR方法58
• 4.3 關(guān)于PEDV、TGEV和PoRV單項(xiàng)LAMP方法58-60
• 第二章 貴州省豬病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查60-79
• 1 材料61-62
• 1.1 樣本收集61
• 1.2 主要試劑61
• 1.3 主要儀器61-62
• 2 方法62-63
• 2.1 發(fā)病狀況與臨床癥狀調(diào)查62
• 2.2 病理變化觀察62-63
• 2.3 PEDV、TGEV和PoRV病原學(xué)調(diào)查63
• 2.4 PEDV、TGEV和PoRV血清學(xué)調(diào)查63
• 3 結(jié)果63-76
• 3.1 發(fā)病情況及臨床癥狀調(diào)查結(jié)果63-66
• 3.2 病理變化觀察結(jié)果66-69
• 3.3 PEDV、TGEV和PoRV病原學(xué)調(diào)查結(jié)果69-74
• 3.4 PEDV、TGEV和PoRV血清學(xué)調(diào)查結(jié)果74-76
• 4 討論76-79
• 4.1 關(guān)于PEDV、TGEV和PoRV感染情況76-77
• 4.2 關(guān)于豬病毒性腹瀉疫苗免疫情況77
• 4.3 關(guān)于豬病毒性腹瀉的流行特點(diǎn)77-79
• 第三章 貴州省PEDV與PoRV分子流行病學(xué)調(diào)查79-109
• 1 材料80
• 1.1 試驗(yàn)病料80
• 1.2 主要試劑80
• 1.3 主要儀器80
• 2 方法80-86
• 2.1 PEDV ORF3基因分子流行病學(xué)調(diào)查80-83
• 2.2 PEDV M基因分子流行病學(xué)調(diào)查83-84
• 2.3 PoRV VP7基因分子流行病學(xué)調(diào)查84-86
• 3 結(jié)果86-107
• 3.1 PEDV ORF3基因分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果86-94
• 3.2 PEDV M基因分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果94-101
• 3.3 PoRV VP7基因分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果101-107
• 4 討論107-109
• 4.1 關(guān)于PEDV ORF3基因特點(diǎn)及變異情況107
• 4.2 關(guān)于PEDV M基因特點(diǎn)及變異情況107-108
• 4.3 關(guān)于PoRV VP7基因分型及變異分析108-109
• 全文結(jié)論109-110
• 參考文獻(xiàn)110-115
• 附錄一 攻讀研究生期間參與發(fā)表文章115-116
• 附錄二 各種培養(yǎng)基、溶液及試劑的配制116-117
• 致謝117-118

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