本文關(guān)鍵詞：新疆尉犁縣哨兵動(dòng)物感染藍(lán)舌病及其病原的分離與鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：藍(lán)舌病(Bluetongue,BT)是由藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的非接觸性的經(jīng)媒介昆蟲(chóng)庫(kù)蠓(Culicoides)傳播感染綿羊、山羊和牛等多種家養(yǎng)和野生反芻動(dòng)物的疾病。該病毒屬于呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬,目前已有27個(gè)血清型。該病的感染與傳播受到庫(kù)蠓活動(dòng)的影響。BT以發(fā)熱、口腔黏膜及舌頭充血、糜爛,嚴(yán)重時(shí)舌頭發(fā)紺為特征性臨床癥狀,并能引起妊娠母畜流產(chǎn)、死胎等,對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)新疆藍(lán)舌病流行病學(xué)調(diào)查的歷史資料及近幾年的BTV血清學(xué)調(diào)查結(jié)果和媒介昆蟲(chóng)庫(kù)蠓的生活習(xí)性,選擇新疆尉犁縣作為監(jiān)控點(diǎn),并放置哨兵動(dòng)物綿羊5只、山羊5只和牛10頭。從2014年5月25日,每周定期采取血樣,共采樣21次,采集血清和肝素鈉抗凝血各420份。采用BTV競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法檢測(cè)哨兵動(dòng)物血清,對(duì)BT感染情況進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè);采集藍(lán)舌病抗體由陰轉(zhuǎn)陽(yáng)的哨兵動(dòng)物血液樣品接種BHK-21進(jìn)行BTV病毒分離;對(duì)分離時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)的樣品,采用BTV抗原捕獲ELISA、BTV群特異性片段VP7的RT-PCR擴(kuò)增及透射電鏡形態(tài)學(xué)觀察,對(duì)CPE樣品進(jìn)行BTV血清群的鑒定。再采用BTV型特異性片段VP2的RT-PCR擴(kuò)增、1~24型的血清及病毒中和實(shí)驗(yàn),鑒定BTV分離毒株的血清型。結(jié)果顯示:BTV競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法共檢出8只哨兵動(dòng)物血清轉(zhuǎn)陽(yáng),其中綿羊轉(zhuǎn)陽(yáng)率15%(3/20),轉(zhuǎn)陽(yáng)時(shí)間為6月~7月;山羊轉(zhuǎn)陽(yáng)率25%(5/20),轉(zhuǎn)陽(yáng)時(shí)間為9月~10月,牛未發(fā)生轉(zhuǎn)陽(yáng)。根據(jù)轉(zhuǎn)陽(yáng)時(shí)間可看出綿羊的易感早于山羊。轉(zhuǎn)陽(yáng)哨兵動(dòng)物抗凝血接種BHK-21細(xì)胞,有7份血樣出現(xiàn)CPE,主要表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、變圓、團(tuán)聚現(xiàn)象,隨后開(kāi)始脫落,間隙加大,形成空斑。分離株經(jīng)BTV抗原捕獲ELISA檢測(cè)均為陽(yáng)性;陽(yáng)性分離毒株電鏡下觀察呈現(xiàn)典型BTV形態(tài)特征:中心的病毒顆粒與核衣殼分界明顯,并被病毒表面的絨毛層包圍,大小約70~80 nm;分離毒株TCID50在10-3.33/0.1 m L~10-5/0.1 m L之間;BTV群特異性片段VP7基因擴(kuò)增、測(cè)序比對(duì)、遺傳進(jìn)化分析與BTV序列的同源性最高為80%~82%。經(jīng)以上鑒定7株分離毒株均為藍(lán)舌病病毒。病毒中和試驗(yàn)結(jié)果表明本次分離毒株及相應(yīng)血清與現(xiàn)有BTV 1~24型均無(wú)中和保護(hù)能力,每孔均發(fā)生CPE;型特異性片段VP2測(cè)序結(jié)果NCBI比對(duì)顯示與現(xiàn)有的BTV血清型毒株同源性從64%到70%不等,與其他病毒無(wú)同源性。由此可得7株分離毒株屬于BTV血清群,但不屬于現(xiàn)有的BTV血清型。結(jié)果表明:本試驗(yàn)首次從新疆分離到了非BTV 1~24型的BTV新毒株,暫定名為XJ/1/2014~XJ/7/2014。初步判定其為BTV的變異株,具體血清型鑒定尚需進(jìn)一步研究確定。
【關(guān)鍵詞】：藍(lán)舌病 病毒 分離 鑒定
【學(xué)位授予單位】：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S855.3
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 英文縮略詞表9-10
• 第1章 緒論10-26
• 1.1 藍(lán)舌病流行情況概述10-14
• 1.1.1 國(guó)外流行情況10-11
• 1.1.2 國(guó)內(nèi)流行情況11-12
• 1.1.3 BTV的傳播12-14
• 1.2 病原學(xué)14
• 1.3 病毒的結(jié)構(gòu)14-17
• 1.3.1 病毒結(jié)構(gòu)蛋白15-17
• 1.3.2 非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2、NS3、NS3A和NS417
• 1.4 BTV的致病機(jī)理與臨床癥狀17-20
• 1.4.1 BTV致病機(jī)理17-19
• 1.4.2 臨床癥狀19-20
• 1.5 BTV的檢測(cè)方法20-22
• 1.5.1 瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID）20
• 1.5.2 競(jìng)爭(zhēng)性ELISA20-21
• 1.5.3 抗原捕獲ELISA21
• 1.5.4 微量血清中和實(shí)驗(yàn)21
• 1.5.5 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）21-22
• 1.6 疫苗的研究22-25
• 1.6.1 弱毒疫苗22-23
• 1.6.2 滅活疫苗23
• 1.6.3 病毒樣顆粒（VLPs）23-24
• 1.6.4 重組疫苗24
• 1.6.5 反向遺傳改造藍(lán)舌病疫苗24-25
• 1.7 防控措施25
• 1.8 小結(jié)25-26
• 第2章 新疆尉犁縣監(jiān)哨兵動(dòng)物血清學(xué)檢測(cè)26-31
• 2.1 監(jiān)控群的建立26
• 2.2 血清學(xué)檢測(cè)26-28
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料26-27
• 2.2.2 檢測(cè)血清的準(zhǔn)備27
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)方法27-28
• 2.3 結(jié)果28-29
• 2.4 討論29-31
• 第3章 新疆尉犁縣哨兵動(dòng)物BT病毒的分離31-37
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料31-32
• 3.1.1 細(xì)胞31
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑31
• 3.1.3 主要的儀器及耗材31-32
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法32-34
• 3.2.1 接種樣品的準(zhǔn)備32
• 3.2.2 BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)32-34
• 3.2.3 細(xì)胞接毒34
• 3.2.4 分離物的保存34
• 3.3 結(jié)果34-36
• 3.4 討論36-37
• 第4章 新疆尉犁縣哨兵動(dòng)物BT分離毒株的鑒定37-61
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料37-38
• 4.1.1 主要試劑37
• 4.1.2 儀器及耗材37-38
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法38-48
• 4.2.1 BTV抗原捕獲ELISA檢測(cè)38-39
• 4.2.2 BTV VP7片段RT-PCR擴(kuò)增39-41
• 4.2.3 BTV VP2片段RT-PCR擴(kuò)增41-44
• 4.2.4 病毒形態(tài)學(xué)觀察44
• 4.2.5 病毒TCID50測(cè)定44-45
• 4.2.6 血清中和實(shí)驗(yàn)45-47
• 4.2.7 病毒中和實(shí)驗(yàn)47-48
• 4.3 結(jié)果48-59
• 4.3.1 BTV抗原捕獲ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果48-49
• 4.3.2 Total RNA提取結(jié)果49
• 4.3.3 BTV VP7片段擴(kuò)增結(jié)果49-51
• 4.3.4 BTV VP2片段RT-PCR擴(kuò)增51-56
• 4.3.5 病毒形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果56
• 4.3.6 病毒TCID50測(cè)定結(jié)果56-57
• 4.3.7 血清中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果57-58
• 4.3.8 病毒中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果58-59
• 4.4 討論59-61
• 第5章 結(jié)論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-69
• 致謝69-70
• 作者簡(jiǎn)歷70

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  本文關(guān)鍵詞：新疆尉犁縣哨兵動(dòng)物感染藍(lán)舌病及其病原的分離與鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：275941