本文關(guān)鍵詞：家兔RERG、TGFBR1基因多態(tài)性與生長性狀關(guān)聯(lián)性分析及TGFBR1對骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：Ras超家族是一類重要的功能蛋白,它們介導(dǎo)生長因子、細(xì)胞因子和多種細(xì)胞外信號(hào)的信息通路,對細(xì)胞生長、分化、存活、增殖等多種功能的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用。Ras家族成員RERG (Ras-related, estrogen-regulated, growth-inhibitory)是GTP/GDP的分子開關(guān)和生長抑制活性基因；轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β)是一組調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的超家族,TGF-βI型受體(transforming gowth faetor preeeptorl TGFβR1/TGFBR1)通過TGF-β/Smad信號(hào)通路在細(xì)胞生長中起負(fù)調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)選取RERG和TGFBR1基因?yàn)樯L候選基因,以伊拉兔、新西蘭兔、艾哥肉兔和天府黑兔共計(jì)978個(gè)樣本為試驗(yàn)材料,采用直接測序法尋找兩個(gè)基因編碼區(qū)的SNPs位點(diǎn)。通過HRM技術(shù)對兩個(gè)基因候選SNPs位點(diǎn)進(jìn)行基因分型,分析候選SNPs位點(diǎn)與家兔生長的相關(guān)性。隨后,選取剛出生的新西蘭兔仔兔為實(shí)驗(yàn)材料,使用酶消化法結(jié)合percoll非連續(xù)密度梯度離心法,分離、純化家兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(Skeletal muscle satellite cells,SCs),采用siRNA介導(dǎo)的TGFBR1基因沉默表達(dá),研究其對家兔SCs增殖的影響。主要結(jié)果如下：1.在RERG基因外顯子5上檢測到3個(gè)同義突變位點(diǎn),分別是c.255 TA,c.264 GA,c.330 GA,三個(gè)SNPs位點(diǎn)完全連鎖。選取c.330 GA位點(diǎn)采用HRM技術(shù)對423只家兔(天府黑兔183只,新西蘭兔120只,艾哥肉兔65只,伊拉兔55只)進(jìn)行基因型分型,并進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。結(jié)果表明：RERG基因AA基因型84日齡體重和42-84日齡日增重顯著高于AG基因型；新西蘭兔AA基因型個(gè)體84日齡體重顯著高于GG基因型個(gè)體；伊拉兔AA基因型個(gè)體42-84日齡平均日增重顯著高于GG基因型。2.在TGFBR1基因外顯子8上檢測到一個(gè)SNP位點(diǎn),C.1264CA,氨基酸密碼子由CGG突變?yōu)锳GG,屬于同義突變,只檢測到CC、CA兩種基因型。采用HRM技術(shù)對555只家兔(天府黑兔206只,新西蘭兔188只,艾哥肉兔161只)對c.1264位點(diǎn)進(jìn)行基因分型,并進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。結(jié)果表明：艾哥肉兔AA基因型個(gè)體56日齡體重顯著高于AC基因型個(gè)體；天府黑兔和新西蘭兔AA基因型個(gè)體70日齡體重顯著高于AC基因型個(gè)體；三個(gè)品種家兔AA基因型個(gè)體84日齡和42-84日齡平均日增重都顯著高于AC基因型。3.選取剛出生的新西蘭白兔后腿肌組織分離、純化得到的SCs,通過形態(tài)學(xué)觀察和免疫組化檢測Desmin標(biāo)志蛋白,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中Desmin呈陽性表達(dá)。表明本試驗(yàn)所分離、純化得到的細(xì)胞為家兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞,且純度滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。4.針對TGFBR1基因,設(shè)計(jì)三對特異的siRNA序列轉(zhuǎn)染SCs,通過q-PCR檢測TGFBR1基因nRNA的相對表達(dá)量,篩選最佳siRNA是si-TGFBR1-01,最佳轉(zhuǎn)染濃度50nmol/L si-TGFBR1-01,轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后對靶基因的mRNA表達(dá)水平的抑制效率為87.61%。5.轉(zhuǎn)染TGFBR1后TGFBR1基因nRNA表達(dá)量下調(diào),同時(shí)TGF-β/Smad信號(hào)通路下游基因Smad3基因也有一定程度下調(diào),作為TGFBR1基因的配體基因TGFB1基因mRNA表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào),MSTN基因mRNA表達(dá)量下調(diào),表明TGFBR1基因通過TGF-β/Smad信號(hào)通路對骨骼肌細(xì)胞增殖相關(guān)基因起負(fù)調(diào)控作用。6.對數(shù)期的SCs細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),檢測在轉(zhuǎn)染50nmol/L si-TGFBR1-0148h后對細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGFBR1基因mRNA被抑制表達(dá)后,細(xì)胞增殖能力顯著高于對照組(P0.05),說明TGFBR1對骨骼肌細(xì)胞的增殖起負(fù)調(diào)控作用。家兔RERG和TGFBR1基因CDS區(qū)的SNPs與生長速度顯著相關(guān),RERG和TGFBR1基因可作為影響家兔生長性狀的重要候選基因。通過對TGFBR1基因的抑制表達(dá),證明TGFBR1基因?qū)趋兰〖?xì)胞增殖起負(fù)調(diào)控作用,為進(jìn)一步研究TGFBR1基因或者TGF-β/Smad信號(hào)通路對骨骼肌細(xì)胞生長發(fā)育的作用提供了理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：家兔 RERG基因 TGFBR1基因 干擾 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S829.1
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 1 文獻(xiàn)綜述13-25
• 1.1 我國家兔養(yǎng)殖現(xiàn)狀概述13-14
• 1.2 四個(gè)家兔品種簡介14-16
• 1.2.1 新西蘭白兔14-15
• 1.2.2 天府黑兔15
• 1.2.3 伊拉配套系15-16
• 1.2.4 艾哥肉兔16
• 1.3 單核苷酸多態(tài)性16-17
• 1.3.1 簡介16-17
• 1.3.2 SNP與家兔育種17
• 1.4 RERG基因17-18
• 1.5 TGFBR1基因18-22
• 1.5.1 TGF-β家族的概述18-19
• 1.5.2 TGF-β受體19-20
• 1.5.3 TGF-β/Smad信號(hào)通路20-22
• 1.5.4 TGFBR122
• 1.6 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞22-23
• 1.6.1 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞簡介22-23
• 1.6.2 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化23
• 1.7 研究目的及主要內(nèi)容23-25
• 1.7.1 本實(shí)驗(yàn)研究目的23-24
• 1.7.2 實(shí)驗(yàn)主要內(nèi)容24-25
• 2 試驗(yàn)材料25-29
• 2.1 試驗(yàn)動(dòng)物選擇與組織采集25
• 2.2 主要設(shè)備及器材25-27
• 2.2.1 分子實(shí)驗(yàn)主要設(shè)備儀器25-26
• 2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)主要設(shè)備儀器26-27
• 2.3 相關(guān)試劑及配制27-29
• 2.3.1 分子實(shí)驗(yàn)主要試劑的配制27-28
• 2.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑及配制28-29
• 3 試驗(yàn)方法29-45
• 3.1 耳組織基因組DNA提取29-30
• 3.2 DNA濃度及純度檢測30-31
• 3.3 RERG和TGFBR1基因引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增和SNPs檢測31-34
• 3.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成31-32
• 3.3.2 常規(guī)PCR反應(yīng)體系及條件32-33
• 3.3.3 直接測序和變異位點(diǎn)篩選33
• 3.3.4 HRM基因分型33-34
• 3.4 新西蘭兔SCs分離、純化、鑒定及培養(yǎng)34-38
• 3.4.1 兔SCs分離及純化34-35
• 3.4.2 SCs的形態(tài)學(xué)鑒定35
• 3.4.3 SCs的免疫組化染色35-36
• 3.4.4 細(xì)胞傳代36
• 3.4.5 冷凍與復(fù)蘇36-37
• 3.4.6 誘導(dǎo)分化和HE染色37-38
• 3.5 siRNA合成及轉(zhuǎn)染細(xì)胞38-39
• 3.5.1 siRNA的合成38
• 3.5.2 有效siRNA篩選38-39
• 3.5.3 siRNA轉(zhuǎn)染濃度篩選39
• 3.6 細(xì)胞總RNA提取和檢測39-41
• 3.6.1 細(xì)胞總RNA提取39-40
• 3.6.2 RNA檢測40-41
• 3.7 細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA41-42
• 3.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR42
• 3.9 細(xì)胞增殖檢測42-43
• 3.10 數(shù)據(jù)處理43-45
• 3.10.1 主要分子生物學(xué)軟件43
• 3.10.2 多態(tài)信息與相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析43-44
• 3.10.3 qPCR組織表達(dá)研究統(tǒng)計(jì)分析44-45
• 4 試驗(yàn)結(jié)果45-63
• 4.1 四個(gè)家兔品種部分個(gè)體生長數(shù)據(jù)45-49
• 4.2 基因組DNA提取結(jié)果49
• 4.3 RERG基因遺傳多態(tài)性及其與家兔生長性能的關(guān)聯(lián)性分析49-54
• 4.3.1 RERG基因PCR擴(kuò)增49-50
• 4.3.2 RERG基因PCR產(chǎn)物測序50-51
• 4.3.3 同義突變SNPs密碼子偏好性分析51
• 4.3.4 RERG基因SNPs位點(diǎn)分型51-52
• 4.3.5 RERG基因c.330G>A位點(diǎn)遺傳多態(tài)性52-53
• 4.3.6 RERG基因c.330G>A位點(diǎn)與家兔不同品種生長性狀關(guān)聯(lián)性分析53-54
• 4.4 TGFBR1基因遺傳多態(tài)性及其與家兔生長性能的關(guān)聯(lián)性分析54-58
• 4.4.1 TGFBR1基因PCR擴(kuò)增54-55
• 4.4.2 TGFBR1基因PCR產(chǎn)物測序55
• 4.4.3 TGFBR1基因SNP位點(diǎn)分型55-56
• 4.4.4 TGFBR1基因c.1264 C>A位點(diǎn)遺傳多態(tài)性56-57
• 4.4.5 TGFBR1基因c.1264 C>A位點(diǎn)與家兔不同品種生長性狀關(guān)聯(lián)性分析57-58
• 4.5 TGFBR1基因?qū)彝霉趋兰⌒l(wèi)星細(xì)胞生長的影響58-63
• 4.5.1 SCs的形態(tài)學(xué)觀察58-59
• 4.5.2 家兔SCs的免疫組化染色鑒定59-60
• 4.5.3 熒光鑒定siRNA轉(zhuǎn)染效率60
• 4.5.4 細(xì)胞總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄60-61
• 4.5.5 有效siRNA篩選61
• 4.5.6 si-TGFBR1-01干擾最佳濃度的篩選61-62
• 4.5.7 轉(zhuǎn)染對TGF-β/Smad信號(hào)通路TGFB1、MSTN和Smad3基因表達(dá)的影響62-63
• 4.5.8 TGFBR1對骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長的影響63
• 5 分析與討論63-67
• 5.1 HRM分型技術(shù)63-64
• 5.2 同義突變的生物學(xué)意義64-65
• 5.3 RERG基因與家兔生長性狀相關(guān)性65
• 5.4 TGFBR1基因與家兔生長性狀相關(guān)性65-66
• 5.5 TGFBR1基因?qū)彝霉趋兰⌒l(wèi)星細(xì)胞生長的影響66-67
• 6 結(jié)論67-68
• 參考文獻(xiàn)68-74
• 致謝74

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