發(fā)布時間：2018-11-13 20:17

【摘要】：布魯氏菌脂多糖(B.melitensis LPS, B-LPS)是布魯氏菌細胞壁的主要成分,它主要由O-抗原、核心多糖和類脂A (LipidA)三部分組成。LipidA是B-LPS的疏水基團,可以將親水性的核心多糖和O-抗原黏附在細菌的外表面構成完整的細胞壁；同時LipidA也是內毒素的活性成分,對B-LPS結構和功能完整性是必不可少的。LipidA的合成是在一系列酶的催化作用下完成的,參與LipidA合成的9種酶及其編碼基因在大部分的革蘭氏陰性細菌中都存在。Caspase-4(Casp4)屬于炎性Caspases家族的一員,在炎癥反應的發(fā)生上扮演重要角色,它是B-LPS的胞內天然免疫受體,在大多數(shù)正常的組織中表達水平很低。 本研究第二章對B-LPS LipidA合成有關的三個重要催化酶的基因LpxC、LpxK和KdtA進行了克隆、原核表達、生物信息學分析及序列比對。結果表明：成功對這三個基因進行了克隆和原核表達,通過生物信息學分析,初步了解了這三個催化酶的二級結構和疏水區(qū)；對不同brucella種屬的這三個基因進行了同源性分析,發(fā)現(xiàn)這三個基因序列相對保守,在各種屬間同源性較高。通過這部分的研究,能幫助我們更好的了解B-LPS LipidA的合成過程,由于LipidA是B-LPS的活性成分,因此為進一步研究B-LPS的功能奠定了基礎。 本研究第三章用不同刺激濃度和刺激時間的B-LPS刺激RAW264.7細胞,對Casp4蛋白表達以及對IL-1β、TNF-a的分泌情況進行了分析。結果表明：B-LPS刺激能引起RAW264.7細胞Casp4蛋白表達上調,同時還能引起IL-1β、TNF-α分泌增加。 本研究第四章應用小干擾RNA(Small interfering RNA, siRNA)抑制B-LPS刺激條件下Casp4蛋白的表達,應用Western blot方法檢測基因沉默效果,通過對轉染條件的反復篩選,確定了最適合的轉染條件；應用酶聯(lián)免疫吸附法檢測轉染后細胞因子分泌水平的變化。結果表明,在B-LPS刺激條件下,siRNA能有效抑制Casp4蛋白的表達；B-LPS刺激條件下,通過siRNA使Casp4knockdown, RAW2647細胞對IL-1β和TNF-α分泌量減少。這些試驗結果為研究通過抑制上游的炎癥通路從而減弱損傷性炎癥反應的實驗設想提供了可能,同時為探究布魯氏菌的致病機理提供了重要依據(jù)。
[Abstract]:Brucella lipopolysaccharide (B.melitensis LPS, B-LPS) is the main component of brucella cell wall, which consists of three parts: O- antigen, core polysaccharide and lipopolysaccharide. LipidA is the hydrophobic group of B-LPS. Hydrophilic core polysaccharides and O- antigens can be adhered to the outer surface of the bacteria to form a complete cell wall; At the same time, LipidA is also an active component of endotoxin, which is essential to the structural and functional integrity of B-LPS. The synthesis of LipidA is completed under the catalysis of a series of enzymes. The nine enzymes involved in LipidA synthesis and their coding genes are present in most gram-negative bacteria. Caspase-4 (Casp4) is a member of the inflammatory Caspases family and plays an important role in the pathogenesis of inflammation. It is the intracellular innate immune receptor of B-LPS and its expression level is very low in most normal tissues. In the second chapter, the genes LpxC,LpxK and KdtA of three important catalytic enzymes related to B-LPS LipidA synthesis were cloned, prokaryotic expression, bioinformatics analysis and sequence alignment. The results showed that the three genes were cloned and expressed successfully. The secondary structure and hydrophobic region of the three catalytic enzymes were preliminarily understood by bioinformatics analysis. The homology analysis of these three genes in different brucella species showed that the three genes were relatively conserved and had high homology among different genera. Through this part of the study, can help us to better understand the synthesis process of B-LPS LipidA, because LipidA is the active component of B-LPS, so for the further study of the function of B-LPS laid a foundation. In the third chapter, the expression of Casp4 protein and the secretion of IL-1 尾, TNF-a were analyzed by B-LPS stimulation with different concentration and time. The results showed that B-LPS stimulation could up-regulate the expression of Casp4 protein and increase the secretion of IL-1 尾 and TNF- 偽 in RAW264.7 cells. In the fourth chapter, small interfering RNA (Small interfering RNA, siRNA) was used to inhibit the expression of Casp4 protein under B-LPS stimulation, and Western blot method was used to detect the gene silencing effect. The most suitable transfection conditions were determined by repeated screening of transfection conditions. Enzyme linked immunosorbent assay (Elisa) was used to detect cytokine secretion after transfection. The results showed that siRNA could effectively inhibit the expression of Casp4 protein under the condition of B-LPS stimulation, and under the condition of B-LPS stimulation, the secretion of IL-1 尾 and TNF- 偽 from Casp4knockdown, RAW2647 cells could be reduced by siRNA. These results provide the possibility to study the experimental assumption of attenuating the injurious inflammatory response by inhibiting the upstream inflammatory pathway, and provide an important basis for exploring the pathogenic mechanism of Brucella.
【學位授予單位】：海南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61

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本文編號：2330310