王叢叢,田欣欣,李三棟,卞志標(biāo),王天奇,閆文朝
（河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng)  471003）

摘要：利用機(jī)率單位法，從30種中草藥中篩選出16種半數(shù)致死濃度（LC50）低于100 g/L的中草藥，分別是五倍子、常山、烏梅、葛根、百部、二花、甘草、黃芩、知母、檳榔、苦楝皮、訶子、貫眾、使君子、巴豆和青蒿，可作為抗結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)候選中草藥，做進(jìn)一步研究。
關(guān)鍵詞：結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)；中草藥；機(jī)率單位法；半數(shù)致死濃度（LC50）
中圖分類號(hào)：S852.72                 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ                 文章編號(hào)：1007－273X（２０１３）０3-0027-02

結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)病（Balantidiosis）是一種人獸共患原蟲(chóng)病，目前已知人及非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、豬等33種動(dòng)物可感染該病，其中豬感染最為普遍，是人和其他動(dòng)物感染的重要傳染源［1］。臨床上常用于該病的硝基咪唑類藥物有“三致”作用，已被要求禁用于食品動(dòng)物［2］。利用體外急性毒性試驗(yàn)方法，篩選可用于抗結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)的中草藥，為人和動(dòng)物結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)病臨床安全用藥提供基本依據(jù)。
1  材料與方法
1.1  材料
1.1.1  蟲(chóng)種  試驗(yàn)用結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體為河南科技大學(xué)寄生蟲(chóng)課程組保存，是取自然發(fā)病的病豬糞便，用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)后獲得的［3］。
1.1.2  試劑及藥品  DMEM培養(yǎng)基，10.0 g裝，Lot No.1342967，GIBCOTM，使用時(shí)按說(shuō)明配成液體。五倍子、常山等30種中草藥購(gòu)自北京同仁堂（洛陽(yáng)）有限公司。2%甲硝唑注射液，河南華利藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字H41020499。
1.2  方法
1.2.1  中草藥水提取物的制備  將備用的中草藥加10倍體積的水浸泡3 h，之后用砂鍋文火水煎2 h，將煎液用篩網(wǎng)濾出，余渣再加10倍體積水，文火水煎2 h，合并兩次煎液，再用文火濃縮到每毫升相當(dāng)生藥0.5 g，高壓滅菌并冷卻后置2~8 ℃條件下備用［4］。
1.2.2  中草藥抗結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)效果的測(cè)定  每種中草藥煎液均設(shè)計(jì)7個(gè)不同濃度梯度，用DMEM培養(yǎng)液將中草藥煎液稀釋成所需濃度的兩倍。取8個(gè)滅菌小安瓿，每安瓿加培養(yǎng)48 h的蟲(chóng)體懸液1 mL，除第一個(gè)安瓿內(nèi)加1 mL DMEM培養(yǎng)液作為對(duì)照外，其余安瓿內(nèi)分別加入相應(yīng)濃度的中草藥煎液1 mL。上述小安瓿加蓋后放入28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，2 h、6 h、12 h后取出觀察。觀察時(shí)，將每個(gè)小安瓿內(nèi)液體充分混勻，吸取40 μL滴于載玻片上，加蓋玻片，于100×鏡暗視野下計(jì)數(shù)30個(gè)視野活蟲(chóng)數(shù)。試驗(yàn)時(shí)以甲硝唑?yàn)橘|(zhì)控藥物，以同樣方法檢測(cè)其不同時(shí)間的半數(shù)致死濃度（LC50）。因沒(méi)有可參考的文獻(xiàn)資料，試驗(yàn)所使用的藥物濃度梯度是在多次預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定的。所有試驗(yàn)中草藥若在100 g/L濃度范圍內(nèi)找到2 h半數(shù)致死濃度，則繼續(xù)尋找6 h和12 h半數(shù)致死濃度，否則不再進(jìn)行試驗(yàn)。
1.2.3  數(shù)據(jù)計(jì)算［5］   以對(duì)照（藥物濃度為0 g/L）樣品試驗(yàn)結(jié)束時(shí)所查獲的活蟲(chóng)數(shù)（30個(gè)視野）為x，以該試驗(yàn)系列各樣品試驗(yàn)結(jié)束時(shí)所查獲的平均活蟲(chóng)數(shù)（30個(gè)視野）為y，將（x-y）/x 的數(shù)值換算為百分?jǐn)?shù)，就是該濃度條件下的蟲(chóng)體死亡率。根據(jù)死亡百分率-機(jī)率單位換算表，將不同濃度下死亡百分率換算成死亡機(jī)率單位。在Excel圖表系統(tǒng)下，以橫軸表示藥物濃度對(duì)數(shù)（lg LC50），以縱軸表示死亡機(jī)率單位，作xy散點(diǎn)圖。順著所獲得的散點(diǎn)作一趨勢(shì)線(直線)，并自動(dòng)獲得該直線的回歸方程。經(jīng)x2檢驗(yàn)回歸線符合要求后，利用該方程可求出死亡機(jī)率單位5（50 %死亡率）時(shí)的藥物濃度對(duì)數(shù)，查反對(duì)數(shù)表就可獲得LC50。利用回歸方法的斜率求出lg LC50標(biāo)準(zhǔn)誤差s，則lg LC50的95%置信限= lg LC50±1.96 s，查反對(duì)數(shù)表就可得到LC50的95%置信限。最后對(duì)中草藥效果進(jìn)行比較和評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析
    結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體具有運(yùn)動(dòng)性，其在藥物作用下運(yùn)動(dòng)能力逐漸減弱，最后停止運(yùn)動(dòng)，表膜破裂或消失。試驗(yàn)以甲硝唑?yàn)橘|(zhì)控藥物，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其2、6、12 h的半數(shù)致死濃度分別是457.80 mg/L、69.05 mg/L 、25.64 mg/L，同以往報(bào)道的結(jié)果一致。黃柏、連翹 、秦皮、梔子、蒼術(shù)、苦參、白頭翁、鴉膽子、黃連、魚腥草、大青葉、公英、穿心連和仙鶴草在100 g/L的濃度范圍內(nèi)均未找到半數(shù)致死濃度，其抗結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)效果較差。其余16種在100 g/L的濃度范圍內(nèi)找到2 h半數(shù)致死濃度，，并進(jìn)一步確定了6 h和12 h半數(shù)致死濃度。由表1可見(jiàn)，2 h半數(shù)致死濃度由低到高的排序?yàn)槲灞蹲印⒊Ｉ�、烏梅、葛根、百部、二花、甘草、黃芩、知母、檳榔、苦楝皮、訶子、貫眾、使君子、巴豆和青蒿。6 h和12 h半數(shù)致死濃度排序與之明顯不同。

3 小結(jié)與討論
    結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)包囊經(jīng)口感染人和動(dòng)物，其在消化液的作用下破裂而釋放出滋養(yǎng)體，后者在消化道內(nèi)進(jìn)行繁殖，人和動(dòng)物免疫力下降或腸道受損時(shí)，其可侵入腸黏膜而致病。雖然硝基咪唑類藥物具有很好的作用效果，但禁用于食品動(dòng)物，病人使用時(shí)也會(huì)出現(xiàn)惡心、嘔吐等消化道反應(yīng)和頭痛、眩暈等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物也因其食口性差而拒食，且存在毒副作用的不確定性，用藥后風(fēng)險(xiǎn)性較大。本試驗(yàn)參考有關(guān)水生動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)方法的基本原理，從 30 種中草藥中初步篩選出 16 種對(duì)結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)有效的品種，為體內(nèi)消滅該蟲(chóng)體提供了理論依據(jù)。
    中草藥煎液成分復(fù)雜，今后要用多種溶劑提取其不同有效成分，進(jìn)一步研究其作用成分和作用機(jī)制。同時(shí)，還要利用動(dòng)物試驗(yàn)對(duì)初步篩選出的中草藥品種進(jìn)一步研究，找出恰當(dāng)?shù)膭┝考皠┬�，以便進(jìn)行臨床試驗(yàn)及推廣。
參考文獻(xiàn):
［1］ 蔣金書．動(dòng)物原蟲(chóng)病學(xué)［M］．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出社,2000．329-333．
［2］ 丁  濤,徐錦忠,沈崇鈺,等．高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定蜂蜜中3種硝基咪唑類殘留［J］．分析化學(xué),2006，34(8)：1206．
［3］ 閆文朝,王天奇,丁  軻,等．DMEM培養(yǎng)結(jié)腸小袋蟲(chóng)的正交試驗(yàn)［J］．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2010，31(8)：34-37．
［4］ 胡元亮．獸醫(yī)中藥學(xué)［M］．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2007.164．
［5］ 周永欣，章宗涉．水生生物毒性試驗(yàn)方法［M］．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1989．114-122．

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