發(fā)布時間：2015-03-03 19:23

劉  春1，王生存1，吳信生2
（1.南通大學實驗動物中心， 江蘇 南通  226001；2.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州  225009）

摘要：利用經篩選多態(tài)性較好的18對微衛(wèi)星引物，對新西蘭白兔、福建黃兔進行遺傳多樣性檢測。研究結果表明，2個兔品種在18個微衛(wèi)星座位上的基因頻率存在一定的差異；新西蘭白兔群體的基因雜合度和多態(tài)信息含量分別為0.593和0.533；福建黃兔群體的基因雜合度和多態(tài)信息含量分別為0.613和0.560。福建黃兔群體基因平均雜合度和平均多態(tài)信息含量較新西蘭白兔高；說明福建黃兔的遺傳多樣性較新西蘭白兔豐富。
關鍵詞：微衛(wèi)星標記；遺傳；多樣性；新西蘭白兔；福建黃兔
中圖分類號：Ｓ829.1                  文獻標識碼：A                 文章編號：1007－273X（２０１３）０4-0008-04

    微衛(wèi)星DNA作為第二代分子遺傳標記廣泛存在于高等真核生物細胞的基因組中，是基因組中種類多、分布廣、具有高度多態(tài)性和雜合度的分子標記，由于其具有多態(tài)性檢出率高、信息含量大、共顯性標記、實驗操作簡單、結果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點，已經成為各類遺傳標記中最有價值的一種［1］。自聯(lián)合國糧農組織將微衛(wèi)星標記作為優(yōu)先推薦的分析工具以來［2］，國內外許多研究人員也開始利用微衛(wèi)星標記對家兔的遺傳多樣性進行分析：如Richardson等［3］利用7個微衛(wèi)星標記分析了澳大利亞5個群體252個野兔個體的遺傳多樣性，結果顯示歐洲野兔在澳大利亞繁衍過程中仍保持了遺傳多樣性；謝喜平等［4］通過16 個微衛(wèi)星標記從DNA 分子水平揭示福建黃兔群體遺傳多態(tài)性，福建黃兔群體中16 個微衛(wèi)星位點共檢測到了100個等位基因，各位點的等位基因數在3~13，平均等位基因數為6~25個。本研究選取經篩選多態(tài)性較好18個微衛(wèi)星標記，采用PCR擴增檢測新西蘭白兔、福建黃兔微衛(wèi)星多態(tài)性，以期揭示這2個兔品種的遺傳多樣性，為家兔種質資源的有效保護和合理利用提供理論依據。
1  材料與方法
1.1  試驗對象選取江蘇省金陵種兔場具備品種特征、健康、發(fā)育良好的新西蘭白兔50只和福建黃兔52只，耳緣靜脈抽取3 mL血樣，肝素鈉抗凝，于-80 ℃下冷凍保存、備用。
1.2  基因組DNA的提取
    家兔血液基因組DNA的提取，，參照《分子克隆實驗指南》第3版［5］。
1.3  引物的合成及信息
    從30對微衛(wèi)星引物中篩選了多態(tài)性較好的18對引物。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。18 對微衛(wèi)星引物及 PCR 反應條件如表1所示。

1.4  PCR擴增體系及條件
    PCR 反應體系 20 μL：10×PCR（Mg2+）Buffer 2 μL，25 mmol/L MgCl2 0.8~1.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L 上下游引物各 1μL，Taq DNA 聚合酶 1.0 U，100 ng/μL DNA模板 1 μL，dd H2O 補至20 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性 45 s，55～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸 10 min，PCR擴增產物4 ℃保存［6］。
1.5  擴增產物的檢測
    PCR擴增產物先在2.0%的瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，膠回收后送上海INVETROGEN公司全自動測序儀檢測。
1.6  數據分析
    利用QUANTITY ONE 軟件計算各等位基因大小、微衛(wèi)星座位的等位基因頻率、多態(tài)信息含量、基因雜合度。
2 結果與分析
2.1 各座位的等位基因數和等位基因頻率
    本試驗通過18對微衛(wèi)星引物檢測了新西蘭白兔和福建黃兔遺傳多樣性，由表2可知2個品種在18個微衛(wèi)星座位共檢測到106個等位基因，其中新西蘭白兔有17個等位基因未檢測到，而在福建黃兔中檢測到；福建黃兔有8個等位基因未檢測到，而在新西蘭白兔中檢測到。新西蘭白兔在18個微衛(wèi)星座位上共檢測到89個等位基因，平均每個位點等位基因數目為4.94個，而福建黃兔檢測到98個等位基因，平均每個位點等位基因數目為5.44個。

2.2 多態(tài)信息含量和基因期望雜合度
    2個兔品種18個微衛(wèi)星座位上的多態(tài)信息含量（PIC）和基因雜合度（H）見表3。

 

    由表3可知，新西蘭白兔群體的基因雜合度和多態(tài)信息含量分別為0.593和0.533；福建黃兔群體的基因雜合度和多態(tài)信息含量分別為0.613和0.560。新西蘭白兔、福建黃兔平均多態(tài)信息含量較新西蘭白兔高；平均基因雜合度也出現(xiàn)了類似的結果，說明福建黃兔的遺傳多樣性較新西蘭白兔豐富。低度多態(tài)性；而在6L1F10位點PIC為0.759，呈高度多態(tài)性，可能是該兔品種在長期的選育過程中不同微衛(wèi)星座位所受選擇壓的差異所造成，也可能是由于選取的等位基因在不同家兔群體中的分布不均所導致。平均基因雜合度表示在被檢測位點上群體中雜合子的頻率，它是群體雜合程度的度量單位。群體平均基因雜合度的高低反映了群體遺傳一致性的程度，群體平均基因雜合度越低，反映該群體的遺傳一致性越高，也就是說群體的遺傳變異越少，群體的遺傳多樣性越差。2個兔品種18個多態(tài)微衛(wèi)星標記的基因雜合度在0.146~0.831之間變動，其中福建黃兔的平均基因雜合度相對較高。多態(tài)信息含量、基因雜合度結果表明，在這2個家兔品種中，福建黃兔可提供的遺傳信息比新西蘭白兔相對要高，這很可能與其所處的獨特地理位置和特定的繁育方式有關，福建黃兔是由福州地區(qū)農民長期自繁自養(yǎng)形成的，后受到外來大型品種兔的沖擊，僅在邊遠山區(qū)僅存少量純種。最終由福建省農科院通過群體繼代選育得以保存［7］。
    新西蘭白兔、福建黃兔是我國應用較為廣泛的家兔品種資源，數量較多的等位基因和豐富的遺傳多樣性已開始被收集和保護，正是我國開展家兔遺傳資源保護的目標，研究結果提示新西蘭白兔和福建黃兔群體具備較大的選擇空間，可以為今后進行品種選育提高、開發(fā)培育新品種等提供豐富的基礎材料和科學依據。
參考文獻：
［1］ 陳民利,蔡月琴,陶  濤,等.微衛(wèi)星標記對WHBE 兔封閉群、日本大耳白兔和新西蘭兔的遺傳分析［J］.中國比較醫(yī)學雜志,2008,18(9):21-27.
［2］ BARKER J S F, MOORE S S, Hetzel D J S, et al. Genetic diversity of Asian water　buffalo (Bubalus bubalis) microsatellite variation and a comparison with protein coding loci［J］. Animal Genetics, 1997(28):103-115.
［3］ RICHARDSONZ. Mapping of rabbit microsatellit e markers using chromosom especific Libraties［J］.Journal of Heredity, 2003,94:161-169.
［4］ 謝喜平,陳巖峰,孫世坤,等. 福建黃兔微衛(wèi)星標記的遺傳多樣性分析［J］. 福建農業(yè)學報，2008（3）:239-243.
［5］ JOSEPH S, DAVID W R. Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Third Edition)［M］. Cold Spring Harbor: CSHL Press, 2002.483-485.
［6］ 張  蕾,石福岳,秦立志, 等.利用熒光多重PCR技術分析8個兔品種遺傳多樣性［J］,安徽農業(yè)科學, 2012,40(24):12262-12266.
［7］ 張愛華.淺談福建黃兔［J］.畜牧獸醫(yī)雜志,2004(6):41.

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