本文關(guān)鍵詞：陜西省漢灘病毒人源分離株全基因組序列分析及血清學(xué)特性研究

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【摘要】：漢坦病毒(Hantavirus, HV)屬于布尼亞病毒科,是分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒。其基因組分為大(Large, L)、中(Medium, M)和小(Small, S)三個(gè)片段,分別編碼核蛋白,糖蛋白(Gn, Gc)和RNA依賴的RNA聚合酶蛋白。人可通過直接或間接接觸宿主動(dòng)物的排泄和分泌物等感染漢坦病毒,引起以腎臟損害為主的腎綜合征出血熱(Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome, HFRS)和以肺毛細(xì)血管通透性增高以及心血管受累為主的漢坦病毒肺綜合征(Hantavirus Pulmonary Syndrome, HPS),全世界有將近30多個(gè)國家每年持續(xù)有漢坦病毒感染報(bào)告病例,我國腎綜合征出血熱疫情最為嚴(yán)重,近十年以來年均發(fā)病人數(shù)一萬左右。目前,已確定的漢坦病毒血清型達(dá)30余種,而引起我國上述傳染病的漢坦病毒主要為漢灘型病毒(Hantaan virus, HTNV)和漢城型病毒(Seoul virus, SEOV)。陜西省是我國受漢坦病毒影響十分嚴(yán)重的兩型病毒混合疫區(qū),但針對宿主動(dòng)物和感染人群的血清學(xué)研究顯示,該地區(qū)主要以漢灘型病毒流行為主,當(dāng)?shù)孛磕昴I綜合征出血熱的報(bào)告病例都居全國前列,發(fā)病高峰集中在每年的冬春兩季,其中春季的3-5月一般為發(fā)病小高峰,而發(fā)病大高峰一般集中在冬季,開始于每年的11月份左右,結(jié)束于次年的1月份。因此,基于上述流行病學(xué)特征,我們選擇于2014冬季在西安地區(qū)進(jìn)行腎綜合征出血熱患者全血采集工作。目前,漢坦病毒的分離難度仍較大,并且現(xiàn)階段大部分漢坦病毒分離株來源于宿主動(dòng)物樣本,而分離自人外周血的毒株尚較少,近十年來西安地區(qū)也僅有從黑線姬鼠鼠肺中分離到漢坦病毒。因此為提高漢坦病毒分離率,本研究嘗試從人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中進(jìn)行漢坦病毒分離,并通過分析病毒分離株的基因組特征,為進(jìn)一步研究宿主來源與HFRS病人來源毒株的相關(guān)性提供依據(jù)。本研究于2014年11月至2015年1月腎綜合征出血熱高發(fā)時(shí)間段,在陜西省西安市第八醫(yī)院采集HFRS患者抗凝血及血清樣本,其中共采集急性期HFRS患者抗凝血樣本共38份,恢復(fù)期病人血清29份。我們對采集的所有抗凝外周血樣本進(jìn)行分離血漿及PBMC處理,并將來自于同一HFRS患者的全血、血漿及外周血單個(gè)核細(xì)胞分別接種于預(yù)先培養(yǎng)好的Vero-E6細(xì)胞表面,并盲傳三代,每代約21天,期間通過熒光定量PCR、雙抗體夾心法ELISA、間接免疫熒光法等檢測方法對盲傳細(xì)胞上清進(jìn)行抗原檢測。經(jīng)過三代盲傳后,上述檢測結(jié)果均顯示有三份樣本的漢坦病毒抗原確定為陽性,其中兩份陽性樣本來源于患者PBMC,而另一份陽性樣本來源于患者血漿,且熒光定量PCR檢測結(jié)果證實(shí)為漢灘型病毒。通過提取病毒RNA,并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,經(jīng)PCR方法進(jìn)行目的片段擴(kuò)增,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后進(jìn)行全基因組測序。經(jīng)測序,我們確定新獲得三株漢灘型病毒毒株的全基因組序列,將上述三株病毒分別命名為SX26、SX27和SX30,測序結(jié)果顯示分離株病毒的S、M、L基因片段大小分別約為1700bp、3580bp及6500bp左右。從GenBank網(wǎng)站下載漢坦病毒各型代表毒株,并通過BLAST比對下載同源性較高毒株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,使用生物信息學(xué)軟件分析分離株病毒與其它漢坦病毒毒株的核苷酸及氨基酸同源性,發(fā)現(xiàn)新分離的三株病毒之間核苷酸與氨基酸相似性均較高,另外,S、M、L片段均與西安2010年鼠源分離株XAAa10091712同源性最近,在系統(tǒng)進(jìn)化樹上歸屬于同一分支。本次研究雖成功從HFRS患者血液樣本中分離到漢坦病毒毒株,但毒株分離途徑不同,分離自PBMC的SX26和SX27毒株未能從同一患者的全血或血漿樣本中分離獲得,而分離自血漿的SX30毒株也未能從PBMC中成功分離,我們推測原因可能是漢坦病毒分離難度較大,在病毒分離培養(yǎng)的過程中存在較多不可控因素,根據(jù)現(xiàn)階段研究結(jié)果,尚無法確定PBMC方法與傳統(tǒng)病毒分離方法相比,在病毒分離率上有明顯優(yōu)勢,然而本研究證明了從PBMC中分離漢坦病毒的可行性,為進(jìn)一步提高漢坦病毒分離率的研究奠定了基礎(chǔ)。針對分離獲得的漢坦病毒毒株,我們進(jìn)一步對其進(jìn)行血清學(xué)特性研究,采用微量中和試驗(yàn)方法,分析所收集的HFRS病人恢復(fù)期血清和疫苗免疫者血清各50份樣本,針對不同漢坦病毒毒株的中和抗體滴度差別。研究確定病人恢復(fù)期血清樣本全部為HTNV型,且對SX26毒株的中和抗體滴度稍高于疫苗株Z10和西安人源分離株84FLi,提示西安地區(qū)漢坦病毒流行株的抗原性已發(fā)生部分改變,且與疫苗株抗原性差別較大。而疫苗免疫者血清針對疫苗株的中和抗體陽性率較高,針對SX26和84FLi毒株的陽性率則較低,推測目前西安地區(qū)所用漢坦病毒疫苗免疫效果可能有所減弱,但還需進(jìn)一步研究予以驗(yàn)證。綜上所述,本研究成功從急性期HFRS病人血液樣本中分離到三株漢灘型病毒株,其中兩株來源于PBMC樣本,另一株來源于血漿樣本,并且全部獲得全基因組序列,證明了PBMC方法分離病毒的可行性,為進(jìn)一步提高漢坦病毒分離率的研究提供了依據(jù)。另外,我們選擇實(shí)驗(yàn)中病毒分離株和其它代表毒株,分別與HFRS病人恢復(fù)期血清和疫苗免疫者血清進(jìn)行微量中和試驗(yàn),對病毒分離株血清學(xué)的特性進(jìn)行分析,同時(shí)也為進(jìn)一步評價(jià)疫苗免疫效果奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：漢坦病毒 病毒分離 外周血單個(gè)核細(xì)胞 全基因組測序 進(jìn)化分析 微量中和試驗(yàn)
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R512.8
【目錄】：

• 英文縮略語5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-18
• 第一部分 陜西省漢灘病毒分離株全基因組測序及進(jìn)化分析18-51
• 引言18-20
• 實(shí)驗(yàn)材料20-22
• 實(shí)驗(yàn)方法22-36
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-48
• 討論48-50
• 小結(jié)50-51
• 第二部分 陜西省漢灘病毒分離株血清學(xué)特性研究51-66
• 引言51-53
• 實(shí)驗(yàn)材料53-56
• 實(shí)驗(yàn)方法56-60
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果60-63
• 討論63-65
• 小結(jié)65-66
• 全文總結(jié)66-67
• 引用文獻(xiàn)67-70
• 致謝70

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：977607