本文關鍵詞：分子模擬技術篩選抗HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶活性化合物

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【摘要】：目的：1.通過網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫技術構(gòu)建非核苷類HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIS)數(shù)據(jù)庫,作為虛擬篩選參考分子庫,其中包括香豆素類天然產(chǎn)物。2.通過分子對接技術對SPECS數(shù)據(jù)庫(含16062個天然產(chǎn)物)、SYSU數(shù)據(jù)庫、中藥化學成分數(shù)據(jù)庫(TCM Bank)與NNRTIS數(shù)據(jù)庫共240950個化合物分子進行虛擬篩選。3.通過體外抗HIV-1活性檢測方法檢測25個候選化合物分子的生物活性,驗證虛擬篩選方法的預測能力。方法：本文主要通過以下方法篩選研究非核苷類抗HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶活性化合物：1.基于數(shù)據(jù)庫資源與數(shù)據(jù)挖掘,利用網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫技術建立非核苷類HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIS)數(shù)據(jù)庫,用于存儲、查詢化合物和靶標結(jié)構(gòu)信息,作為虛擬篩選的參考分子庫。數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建主要應用目前比較流行的LAMP網(wǎng)站架構(gòu),包括Linux操作系統(tǒng),Apache HTTP服務器,MySQL數(shù)據(jù)庫和PHP腳本語言。2.利用SPECS數(shù)據(jù)庫(含16062個天然產(chǎn)物)、SYSU數(shù)據(jù)庫、中藥化學成分數(shù)據(jù)庫(TCM Bank)與NNRTIS數(shù)據(jù)庫構(gòu)建虛擬分子庫,作為虛擬篩選的候選分子庫。3.利用RCSB PDB (Protein Data Bank)蛋白數(shù)據(jù)庫資源,使用MOE、SYBYL、 Schrodinger、Discovery Studio四大藥物設計軟件的分子對接模塊進行HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶晶體結(jié)構(gòu)的自身對接,根據(jù)對接構(gòu)象、晶體結(jié)構(gòu)分辨率、配體結(jié)構(gòu)特點,為虛擬篩選選擇合適的蛋白晶體結(jié)構(gòu)。4.基于分子對接技術與DUD(A Directory of Useful Decoys)數(shù)據(jù)庫資源,使用四大藥物設計軟件的分子對接模塊將43個非核苷類抗HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶配體與430個結(jié)構(gòu)相似的非活性化合物分別對接到HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶晶體結(jié)構(gòu)的結(jié)合口袋,根據(jù)對接打分建立ROC曲線模型,選用合適的分子對接模塊作為虛擬篩選的方法。5.使用MOE軟件對候選分子庫分子進行能量優(yōu)化得到分子低能構(gòu)象,使用WEGA分子三維相似性程序?qū)⒎肿拥湍軜?gòu)象與晶體結(jié)構(gòu)配體進行三維相似性疊合得到分子疊合構(gòu)象,使用Discovery Studio軟件對每個分子的低能構(gòu)象和疊合構(gòu)象分別進行構(gòu)象搜索,將搜索到的構(gòu)象作為虛擬篩選的分子構(gòu)象。6.利用合適的分子對接模塊將候選分子的分子構(gòu)象對接到HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶晶體結(jié)構(gòu)的結(jié)合口袋,統(tǒng)計分析對接結(jié)果,選擇打分較高和結(jié)合模式較優(yōu)的化合物作為生物活性測試的候選分子。7.采用國際通用實驗方法對候選分子進行體外抗HIV-1活性檢測,得到每個化合物抑制HIV-IIIB病毒感染的C8166淋巴細胞合胞體形成50%時的濃度(EC50),對50%正常T淋巴細胞系C8166產(chǎn)生毒性時的濃度(CC50),治療指數(shù)TI(EC50/CC50)。結(jié)果：1.采用網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫技術,利用LAMP網(wǎng)站架構(gòu)成功構(gòu)建了非核苷類HIV-1逆轉(zhuǎn)錄抑制劑(NNRTIS)數(shù)據(jù)庫,數(shù)據(jù)庫存儲1340個化合物和205個靶標結(jié)構(gòu)信息,同時實現(xiàn)了化合物名稱、化合物SMILE格式描述符、靶標名稱和靶標PDB ID四種檢索方式。2.構(gòu)建的候選分子庫共有240950個小分子化合物,其中包括SPECS數(shù)據(jù)庫小分子化合物201762個,SYSU數(shù)據(jù)庫化合物7097個,TCM Bank數(shù)據(jù)庫小分子30751個,NNRTIS數(shù)據(jù)庫小分子1340個。3.通過對HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶晶體結(jié)構(gòu)的分析和自身對接,選擇參與虛擬篩選的蛋白晶體結(jié)構(gòu)PDB ID為2ZD1。4.將DUD數(shù)據(jù)庫的473個小分子進行分子對接,并建立了ROC曲線模型,根據(jù)AUC面積大小選擇Schrodinger藥物設計軟件Glide SP對接模塊作為虛擬篩選方法。5.使用MOE軟件為每個小分子生成低能構(gòu)象,應用WEGA軟件包為每個小分子生成疊合構(gòu)象,使用Discovery Studio軟件為每個低能構(gòu)象和疊合構(gòu)象分別生成10個構(gòu)象,最后每個分子得到20個構(gòu)象。6.通過Glide SP對接模塊成功將240950個化合物的分子構(gòu)象對接到HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶晶體結(jié)構(gòu)2ZD1的結(jié)合口袋,分析虛擬篩選結(jié)果,最后選擇25個具有化學結(jié)構(gòu)代表性的化合物進行體外抗HIV-1生物活性測試。7.虛擬篩選結(jié)果顯示240950個化合物分子中,抑制劑與未知活性分子打分分布曲線明顯分離,打分均值分別為-9和-7,而對接打分大于11.0的165個化合物分子中,抑制劑與未知活性分子打分分布曲線明顯接近,打分均值為-11.32和-11.38,這些結(jié)果說明該虛擬篩選方法具有一定的預測能力,打分較高的分子具有抗HIV活性的可能性較大。8.虛擬篩選結(jié)果顯示對接打分大于11.0的165個化合物分子中,抑制劑分子占到27.20%,抑制劑利匹韋林的打分總排名第2位,中藥成分占到6.0%,來自TCM Bank數(shù)據(jù)庫的中草藥活性成分Inphyllum P打分總排名98位,文獻報道其分子水平抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的活性值ECso為0.13 uM,這些結(jié)果都充分驗證了該虛擬篩選方法具有一定的可靠性和準確性。9.通過分析對接打分大于11.0的165個化合物分子中45個抑制劑的虛擬篩選結(jié)果得出：打分越高,與殘基Lys101形成氫鍵,與殘基TYR181,TRP229形成π-π堆積作用,對接構(gòu)象呈現(xiàn)類馬蹄狀柔性構(gòu)象的化合物分子具有逆轉(zhuǎn)錄酶抑制活性的可能性越大。10.本文對25個化合物進行體外抗HIV-1生物活性測試,25個化合物分子都具有抗HIV-1活性,其中10個化合物抑制HIV-1ItIB病毒感染的C8166淋巴細胞合胞體形成50%時的濃度即EC50值小于10ug/ml,化合物1-(4-fluorophenyl)-3-[2-(1H-indol-3-y1)ethyl]thiourea與6-[[5-(4-chloroanilino)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]methoxy]-4-methylchromen-2-one的治療指數(shù)(TI)大于10。11.生物活性和虛擬篩選實驗結(jié)果顯示化合物1-(4-fluorophenyl)-3-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]thiourea對50%正常T淋巴細胞系C8166產(chǎn)生毒性時的濃度(CC50)大于100,EC50值為4.54 ug/ml,治療指數(shù)(TI)大于18.35,其對接構(gòu)象呈U形,與晶體結(jié)構(gòu)中內(nèi)嵌配體非常接近,與HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合口袋重要殘基Lys101形成氫鍵,與保守殘基Trp229和芳香殘基Tyr181分別形成π-π堆積作用。化合物6-[[5-(4-chloroanilino)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]methoxy]-4-methylchromen-2-one的CC5o值大于100,EC50值為9.85 ug/ml,TI值大于10.15,其對接構(gòu)象呈類馬蹄狀,與殘基Lys101、Lys103形成氫鍵,與殘基Trp229、Tyrl81形成π-π堆積作用。生物活性測試結(jié)果與虛擬篩選結(jié)果相吻合,充分證明了虛擬篩選方法的可靠性。結(jié)論：1.從化合物結(jié)構(gòu)考慮,U形、類馬蹄形柔性結(jié)構(gòu)的非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑能通過調(diào)整自身結(jié)構(gòu)更好的適應HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合口袋的變化,對抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶活性起到關鍵作用。2.從逆轉(zhuǎn)錄酶殘基考慮,抑制劑與HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶重要殘基Lys101形成氫鍵,與保守殘基Trp229、芳香殘基Tyrl81分別形成π-π堆積作用,這樣的相互作用模式使得抑制劑與HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)合更加的穩(wěn)定,對抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶活性起到主要作用。3.從化合物抗HIV活性考慮,25個化合物分子都具有抗HIV-1活性,除了TI大于10的兩個化合物之外,其他化合物活性都較弱,這說明本文建立的虛擬篩選方法是高通量篩選方法,具有一定的預測能力和可靠性,可以縮小活性化合物的篩選范圍,在準確性上還需要結(jié)合分子動力學模擬等方法進行深入的研究。4.從篩選方法考慮,網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫、分子模擬與活性實驗相結(jié)合能快速的進行活性化合物的篩選,為基于結(jié)構(gòu)的非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的設計提供新的思路和方法。網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫資源為化合物的虛擬篩選提供寶貴的數(shù)據(jù)資源,網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫技術可用于存儲、查詢結(jié)構(gòu)信息,并為分子模擬構(gòu)建候選分子庫。分子模擬技術可用于化合物與蛋白質(zhì)相互作用模式的預測,能縮小活性化合物篩選范圍。體外抗HIV-1活性檢測能快速的驗證虛擬篩選方法的可靠性和準確性。
【關鍵詞】：HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶 分子模擬技術 網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫技術 分子對接 非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R512.91
【目錄】：

• 摘要3-6
• Abstract6-13
• 引言13-15
• 第一章 文獻研究15-25
• 1.1 非核苷類HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑研究進展15-19
• 1.1.1 HIV-1生命周期15-16
• 1.1.2 HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)16
• 1.1.3 非核苷類HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑作用機理研究16-18
• 1.1.4 DAPYS類HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑研究18-19
• 1.2 計算機輔助藥物設計技術的應用和研究19-21
• 1.2.1 藥物設計理論19-20
• 1.2.2 藥物設計軟件20
• 1.2.3 分子相似性20-21
• 1.2.4 化學軟件21
• 1.3 網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫資源的應用和研究21-25
• 1.3.1 數(shù)據(jù)庫資源研究現(xiàn)狀21-22
• 1.3.2 蛋白數(shù)據(jù)庫22
• 1.3.3 生物活性數(shù)據(jù)庫22
• 1.3.4 化學數(shù)據(jù)庫22-23
• 1.3.5 分子模擬數(shù)據(jù)庫23-25
• 第二章 網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫建設25-31
• 2.1 數(shù)據(jù)來源25
• 2.1.1 數(shù)據(jù)收集25
• 2.1.2 格式轉(zhuǎn)換25
• 2.2 網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫技術25-26
• 2.2.1 網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫架構(gòu)25
• 2.2.2 網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫原理25-26
• 2.3 平臺搭建與數(shù)據(jù)庫表單創(chuàng)建26-27
• 2.3.1 環(huán)境配置26
• 2.3.2 表單創(chuàng)建26-27
• 2.4 界面設計和程序編寫27-29
• 2.4.1 檢索界面設計27-28
• 2.4.2 后臺程序設計28
• 2.4.3 展示界面設計28-29
• 2.5 數(shù)據(jù)庫使用和發(fā)布29-30
• 2.5.1 數(shù)據(jù)庫檢索方法29
• 2.5.2 數(shù)據(jù)庫檢索原理29
• 2.5.3 數(shù)據(jù)庫的發(fā)布29-30
• 2.6 小結(jié)30-31
• 第三章 虛擬篩選31-48
• 3.1 前言31-33
• 3.1.1 分子對接原理31-32
• 3.1.2 分子對接軟件32-33
• 3.1.3 分子對接數(shù)據(jù)庫33
• 3.2 候選分子庫構(gòu)建33-34
• 3.2.1 數(shù)據(jù)收集33-34
• 3.2.2 分子結(jié)構(gòu)格式校對34
• 3.3 靶標蛋白晶體結(jié)構(gòu)的選擇34-37
• 3.3.1 蛋白晶體結(jié)構(gòu)選擇原則34-35
• 3.3.2 蛋白晶體結(jié)構(gòu)的檢索35-36
• 3.3.3 蛋白晶體結(jié)構(gòu)的自身對接36-37
• 3.3.4 數(shù)據(jù)分析37
• 3.4 建立基于分子對接方法的ROC篩選模型37-41
• 3.4.1 數(shù)據(jù)來源37
• 3.4.2 分子構(gòu)象準備37-38
• 3.4.3 分子對接方法38-39
• 3.4.4 ROC篩選模型建立39-41
• 3.5 虛擬篩選與選擇測試化合物41-46
• 3.5.1 虛擬篩選41
• 3.5.2 對接打分的分布圖分析41-42
• 3.5.3 對接打分靠前分子的組成分析42-43
• 3.5.4 打分靠前的抑制劑對接模式分析43-45
• 3.5.5 測試化合物選擇45-46
• 3.6 小結(jié)46-48
• 第四章 體外抗HIV-1活性實驗研究48-55
• 4.1 體外抗HIV-1活性實驗48-49
• 4.1.1 檢測材料48
• 4.1.2 HIV-1感染性實驗48
• 4.1.3 對C8166細胞的毒性實驗48
• 4.1.4 對HIV-1ⅢB致細胞病變(CPE)的抑制實驗48-49
• 4.2 生物活性測試結(jié)果與討論分析49-54
• 4.2.1 生物活性測試候選化合物結(jié)構(gòu)49-50
• 4.2.2 生物活性測試結(jié)果與分析50-52
• 4.2.3 化合物體外活性與對接模式分析52-53
• 4.2.4 討論分析53-54
• 4.3 小結(jié)54-55
• 結(jié)語55-57
• 參考文獻57-64
• 附錄64-65
• 研究生在讀期間發(fā)表論文情況65-66
• 致謝66

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 高躍東;黃京飛;;Discovery Studio 2.0的模塊擴展及應用:殘基水平非鍵相互作用能量的自動批量計算[J];動物學研究;2011年03期

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本文編號：965247