本文關鍵詞：異性傳播HIV的準種傳播和進化規(guī)律研究

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【摘要】：背景HIV感染溯源研究對于了解HIV的傳播和進化規(guī)律、開展HIV職業(yè)暴露感染鑒定、醫(yī)源性感染調查和司法調查等具有重要價值。國外文獻報道的實驗室方法主要有PCR產(chǎn)物直接測序、巢式PCR產(chǎn)物克隆測序、終點有限稀釋PCR產(chǎn)物測序,用于在HIV基因亞型或準種水平上推斷HIV的傳播關系甚至傳播方向。但這些方法要么所獲得的信息量小、要么操作繁瑣。本課題組趙琦等將Miseq高通量測序(以下簡稱Miseq測序)成功地用于一起疑似經(jīng)性傳播HIV的感染溯源調查,通過提取血漿中RNA、反轉錄、巢式PCR擴增后進行Miseq測序,可以推斷HIV的傳播關系和傳播方向,提供了一種操作較簡便、成本較低、實用價值較高的HIV感染溯源調查技術。本研究對前期建立的HIV Miseq測序分析技術進行了優(yōu)化,選擇傳播關系和傳播時間明確的7對婚內傳播HIV夫妻作為研究對象,研究異性傳播HIV的準種傳播和進化規(guī)律。目的1、研究異性傳播HIV的準種群傳播規(guī)律。2、探討樣本類型(全血、血漿)及抗病毒治療對結果分析的潛在影響。3、探討婚內性傳播HIV感染者的個體內及夫妻間HIV準種隨感染時間的進化規(guī)律。材料和方法1、研究對象(1)選擇傳播關系明確、傳播時間在1.5年以內的7對婚內性傳播HIV夫妻(其中6對夫妻傳播時間在半年以內)作為研究對象,編號為F1/M1～F7/M7。流行病學調查顯示：7對夫妻中的先感染者通過非婚異性性接觸(6人)或注射毒品(1人)感染HIV,之后分別傳染了其配偶。其中,6對夫妻的婚內性傳播方向為男傳女、1對為女傳男。14名研究對象中除F3、F5、M5、F7、M7已進行0.5～57個月的抗病毒治療(Antiretroviral Th(rapy, ART)外,大部分未治療過。采集7對夫妻的血液樣本,于-80℃保存全血、血漿樣本各14份。(2)對1對夫妻(F1、M1)進行連續(xù)隨訪采樣,采樣時間間隔為3-23個月。其中F1隨訪采樣至感染后54個月,分別收集9個時間點的血漿樣本9份、全血樣本7份,共計16份；M1隨訪采樣至感染后37個月(他在感染后第42個月死亡),分別收集6個時間點的血漿樣本6份、全血樣本5份,共計11份。2、實驗方法(1)從血漿樣本中提取RNA,從全血樣本中提取總核酸；(2)對RNA產(chǎn)物進行逆轉錄,合成cDNA；(3)對cDNA、總核酸進行巢式PCR擴增目的片段(用于基因亞型分析及Miseq測序的目的片段不同,引物不同)；(4)瓊脂糖凝膠電泳及紫外成像檢測；(5)PCR產(chǎn)物直接測序及基因亞型分析；(6) Miseq測序：對前期方法進行優(yōu)化,主要包括：①單樣本建庫代替混合樣本建庫；②采用PE300程序代替PE250。測序后對準種序列進行系統(tǒng)進化樹分析。結果1、7對夫妻的分析結果(1)HIV基因亞型：每對夫妻的HIV基因亞型都分別相同,F1和M1、F3和M3同為HIV-101BC亞型,F4和M4同為HIV-1 CRF07_BC亞型,F5和M5同為HIV-1 CRF08_BC亞型,F2和M2、F6和M6、F7和M7同為HIV-1 CRF01_AE亞型�；騺喰头治鼋Y果支持婚內性傳播的流行病學調查結果。(2)HIV準種群分布：在28份樣本中,24份擴增成功并進行Miseq測序。其中所有全血樣本均擴增成功,第3對、第5對夫妻共4人的血漿樣本擴增失敗。分析頻數(shù)50及以上的準種群序列,血漿樣本獲得的有效序列數(shù)為83290-209120(平均154176)條,代表29～455(平均139)個準種群,每份樣本中,頻數(shù)最高的準種群占所有序列總頻數(shù)的比例為10.0%-98.9%(平均51.4%)；全血樣本獲得的有效序列數(shù)為67831-193202(平均134219)條,代表12～284(平均97)個準種群,每份樣本中,頻數(shù)最高的準種群占所有序列總頻數(shù)的比例為25.2%～99.2%(平均75.0%)。血漿、全血樣本獲得的有效序列數(shù)和準種群數(shù)均無顯著性差異(p0.05),全血樣本中頻數(shù)最高的準種群占總序列的比例明顯高于血漿樣本(p0.05)。20/24的樣本中頻數(shù)最高(最優(yōu)勢)的前20個準種群序列的頻數(shù)之和占HIV準種群所有序列總頻數(shù)的比例都超過了80%,只有1份(M2P)較低(約45%),另外3份樣本達到70%(M6P、M6W、M7P)。9/14的研究對象(F1、 F2、F3、M3、F4、M4、F5、M5、M7)全血樣本中第1個優(yōu)勢序列頻數(shù)占了85%以上。(3)基因離散率變化范圍：各研究對象的樣本內基因離散率為0.6%-4.4%(血漿樣本)或0.5%-4.0%(全血樣本),血漿、全血樣本所得的樣本內基因離散率之間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。夫妻間HIV的平均基因離散率為0.7%-5.1%(血漿樣本)或0.5%～6.8%(全血樣本)。(4)系統(tǒng)進化樹分析：每對夫妻的HIV準種序列分別單獨聚集在一簇,伴有較高的bootstrap值(大于90),結合基因離散率,提示夫妻間存在傳播關系,并排除實驗交叉污染的可能性。系統(tǒng)進化樹可以顯示樣本間的并系關系進而推斷傳播方向,除了第1對夫妻單獨分析血漿樣本以外,其他樣本在單獨分析血漿、全血樣本或混合分析2類樣本時,均得到正確的傳播方向。夫妻2人感染時間的間隔越長,序列區(qū)分越清楚,如第2對夫妻感染時間相差8年以上,HIV序列各自聚集；而第1對夫妻感染時間接近(窗口期傳播),2人的多數(shù)序列互相交集。(5)樣本類型及抗病毒治療對結果分析的潛在影響：血漿樣本擴增的是RNA中的目的片段,10/14份樣本擴增成功；全血樣本擴增的是前病毒DNA中的目的片段,全部擴增成功。二者獲得的準種群序列數(shù)量相當。判斷傳播方向時,4/5對夫妻的血漿樣本及7/7對夫妻的全血樣本可以準確判定�？共《局委煹�5個研究對象中,血漿樣本只有2人擴增成功,而全血樣本全部擴增成功；全血、血漿樣本的Miseq測序結果都可以正確判斷傳播關系及傳播方向。第7對夫妻中的先感染者已進行抗病毒治療57個月,也同樣能識別傳播關系及傳播方向。2、第1對夫妻隨訪樣本的分析結果(1)HIV準種群分布：在后感染者F1的16份樣本中,血漿樣本8份Miseq測序成功,1份失��；全血樣本7份全部Miseq測序成功。先感染者Ml的11份樣本中,血漿、全血樣本全部擴增成功。F1獲得的有效序列數(shù)如下：血漿樣本為83290～180118(平均131094)條,全血樣本為83329～175811(平均122444)條,分別代表23～322(平均125)個、12～190(平均67)個準種群。M1獲得的有效序列數(shù)如下：血漿樣本為69949～172087(平均114462)條,全血樣本為75115～259369(平均166507)條,分別代表41～311(平均145)個、22～188(平均98)個準種群。F1、M1血漿的準種分布有隨時間逐漸分散的趨勢,全血的準種群分布變化規(guī)律不如血漿明顯。(2)基因離散率：隨訪樣本中的HIV準種群的基因離散率隨著時間的推移均有逐漸增大的趨勢,從感染后1月到37月,Fl樣本內的平均基因離散率從0.7%(血漿)、0.6%(全血)增加到2.3%(血漿)、3.1%(全血),M1樣本內的平均基因離散率從0.6%(血漿)、0.8%(全血)增加到0.7%(血漿)、2.7%(全血)。針對每個受檢者,不同時間隨訪采樣與第1次采樣之間的基因離散率也有不斷增加的趨勢,F1在感染后3月及37月時,樣本與第1次采樣(感染后1月)之間的平均基因離散率從0.9%(血漿)、0.6%(全血)增加到2.5%(血漿)、3.4%(全血),M1在感染后3月及37月時,樣本與第1次采樣(感染后1月)之間的平均基因離散率從0.8%(血漿)、0.7%(全血)增加到4.1%(血漿)、3.2%(全血)。隨著時間的推進,夫妻間的基因離散率不斷增加,從感染后1月到37月,夫妻間的平均基因離散率從0.7%(血漿)、0.7%(全血)增加到5.4%(血漿)、4.7%(全血)。(3)系統(tǒng)進化樹分析：感染早期,各樣本的準種群序列分布較為集中,樣本之間的準種群序列分布也很接近,但隨著感染時間的推移,樣本內的準種群序列分布逐漸分散,各樣本之間的準種群分布也逐漸遠離。除了感染后12月的系統(tǒng)進化樹判定傳播方向錯誤,其他樣本在單獨分析血漿、全血樣本或混合分析2類樣本時,均得到正確的傳播方向。結論1、通過對7對婚內性傳播HIV夫妻感染者的準種傳播情況進行分析,Miseq測序結果支持傳播關系及傳播方向的流行病學調查結果；抗病毒治療未影響傳播關系及傳播方向的判定。2、HIV準種群的多樣性和頻數(shù)分布有助于了解HIV的傳播和進化規(guī)律,全血樣本所得的HIV感染溯源分析結果比血漿樣本更可靠、更實用。3、隨著時間的推進,不同時間隨訪采樣與第1次采樣之間的基因離散率不斷增加,夫妻間的基因離散率也不斷增加。參照國外報道,感染后3年時,隨訪采樣與第1次采樣之間的基因離散率可達到3%,傳染源與感染者之間的基因離散率可達到5%左右。4、對于傳播方向的判定,要考慮多種因素：(1)采樣距感染時間；時間越短,越容易判定,具體到多少年有待進一步研究；(2)2個感染者的感染時間間隔；間隔越長越容易判定,窗口期傳播在判定傳播方向時要特別慎重,尤其是采樣距傳播時間較長時。
【關鍵詞】：艾滋病 疾病傳播 分子流行病學 高通量測序技術 準種群
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R512.91
【目錄】：

• 摘要5-9
• ABSTRACT9-14
• 前言14-17
• 研究對象17-19
• 主要設備、試劑及耗材19-21
• 實驗方法21-34
• 結果34-47
• 討論47-50
• 結論50-51
• 參考文獻51-54
• 附錄1 已發(fā)表論著54-59
• 附錄2 綜述59-67
• 參考文獻65-67
• 致謝67-69
• 個人簡介69

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本文編號：953154