本文關(guān)鍵詞：異性傳播HIV的準(zhǔn)種傳播和進(jìn)化規(guī)律研究

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【摘要】：背景HIV感染溯源研究對(duì)于了解HIV的傳播和進(jìn)化規(guī)律、開(kāi)展HIV職業(yè)暴露感染鑒定、醫(yī)源性感染調(diào)查和司法調(diào)查等具有重要價(jià)值。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)室方法主要有PCR產(chǎn)物直接測(cè)序、巢式PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序、終點(diǎn)有限稀釋PCR產(chǎn)物測(cè)序,用于在HIV基因亞型或準(zhǔn)種水平上推斷HIV的傳播關(guān)系甚至傳播方向。但這些方法要么所獲得的信息量小、要么操作繁瑣。本課題組趙琦等將Miseq高通量測(cè)序(以下簡(jiǎn)稱Miseq測(cè)序)成功地用于一起疑似經(jīng)性傳播HIV的感染溯源調(diào)查,通過(guò)提取血漿中RNA、反轉(zhuǎn)錄、巢式PCR擴(kuò)增后進(jìn)行Miseq測(cè)序,可以推斷HIV的傳播關(guān)系和傳播方向,提供了一種操作較簡(jiǎn)便、成本較低、實(shí)用價(jià)值較高的HIV感染溯源調(diào)查技術(shù)。本研究對(duì)前期建立的HIV Miseq測(cè)序分析技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,選擇傳播關(guān)系和傳播時(shí)間明確的7對(duì)婚內(nèi)傳播HIV夫妻作為研究對(duì)象,研究異性傳播HIV的準(zhǔn)種傳播和進(jìn)化規(guī)律。目的1、研究異性傳播HIV的準(zhǔn)種群傳播規(guī)律。2、探討樣本類型(全血、血漿)及抗病毒治療對(duì)結(jié)果分析的潛在影響。3、探討婚內(nèi)性傳播HIV感染者的個(gè)體內(nèi)及夫妻間HIV準(zhǔn)種隨感染時(shí)間的進(jìn)化規(guī)律。材料和方法1、研究對(duì)象(1)選擇傳播關(guān)系明確、傳播時(shí)間在1.5年以內(nèi)的7對(duì)婚內(nèi)性傳播HIV夫妻(其中6對(duì)夫妻傳播時(shí)間在半年以內(nèi))作為研究對(duì)象,編號(hào)為F1/M1～F7/M7。流行病學(xué)調(diào)查顯示：7對(duì)夫妻中的先感染者通過(guò)非婚異性性接觸(6人)或注射毒品(1人)感染HIV,之后分別傳染了其配偶。其中,6對(duì)夫妻的婚內(nèi)性傳播方向?yàn)槟袀髋?對(duì)為女傳男。14名研究對(duì)象中除F3、F5、M5、F7、M7已進(jìn)行0.5～57個(gè)月的抗病毒治療(Antiretroviral Th(rapy, ART)外,大部分未治療過(guò)。采集7對(duì)夫妻的血液樣本,于-80℃保存全血、血漿樣本各14份。(2)對(duì)1對(duì)夫妻(F1、M1)進(jìn)行連續(xù)隨訪采樣,采樣時(shí)間間隔為3-23個(gè)月。其中F1隨訪采樣至感染后54個(gè)月,分別收集9個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血漿樣本9份、全血樣本7份,共計(jì)16份；M1隨訪采樣至感染后37個(gè)月(他在感染后第42個(gè)月死亡),分別收集6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血漿樣本6份、全血樣本5份,共計(jì)11份。2、實(shí)驗(yàn)方法(1)從血漿樣本中提取RNA,從全血樣本中提取總核酸；(2)對(duì)RNA產(chǎn)物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,合成cDNA；(3)對(duì)cDNA、總核酸進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增目的片段(用于基因亞型分析及Miseq測(cè)序的目的片段不同,引物不同)；(4)瓊脂糖凝膠電泳及紫外成像檢測(cè)；(5)PCR產(chǎn)物直接測(cè)序及基因亞型分析；(6) Miseq測(cè)序：對(duì)前期方法進(jìn)行優(yōu)化,主要包括：①單樣本建庫(kù)代替混合樣本建庫(kù)；②采用PE300程序代替PE250。測(cè)序后對(duì)準(zhǔn)種序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。結(jié)果1、7對(duì)夫妻的分析結(jié)果(1)HIV基因亞型：每對(duì)夫妻的HIV基因亞型都分別相同,F1和M1、F3和M3同為HIV-101BC亞型,F4和M4同為HIV-1 CRF07_BC亞型,F5和M5同為HIV-1 CRF08_BC亞型,F2和M2、F6和M6、F7和M7同為HIV-1 CRF01_AE亞型�；騺喰头治鼋Y(jié)果支持婚內(nèi)性傳播的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果。(2)HIV準(zhǔn)種群分布：在28份樣本中,24份擴(kuò)增成功并進(jìn)行Miseq測(cè)序。其中所有全血樣本均擴(kuò)增成功,第3對(duì)、第5對(duì)夫妻共4人的血漿樣本擴(kuò)增失敗。分析頻數(shù)50及以上的準(zhǔn)種群序列,血漿樣本獲得的有效序列數(shù)為83290-209120(平均154176)條,代表29～455(平均139)個(gè)準(zhǔn)種群,每份樣本中,頻數(shù)最高的準(zhǔn)種群占所有序列總頻數(shù)的比例為10.0%-98.9%(平均51.4%)；全血樣本獲得的有效序列數(shù)為67831-193202(平均134219)條,代表12～284(平均97)個(gè)準(zhǔn)種群,每份樣本中,頻數(shù)最高的準(zhǔn)種群占所有序列總頻數(shù)的比例為25.2%～99.2%(平均75.0%)。血漿、全血樣本獲得的有效序列數(shù)和準(zhǔn)種群數(shù)均無(wú)顯著性差異(p0.05),全血樣本中頻數(shù)最高的準(zhǔn)種群占總序列的比例明顯高于血漿樣本(p0.05)。20/24的樣本中頻數(shù)最高(最優(yōu)勢(shì))的前20個(gè)準(zhǔn)種群序列的頻數(shù)之和占HIV準(zhǔn)種群所有序列總頻數(shù)的比例都超過(guò)了80%,只有1份(M2P)較低(約45%),另外3份樣本達(dá)到70%(M6P、M6W、M7P)。9/14的研究對(duì)象(F1、 F2、F3、M3、F4、M4、F5、M5、M7)全血樣本中第1個(gè)優(yōu)勢(shì)序列頻數(shù)占了85%以上。(3)基因離散率變化范圍：各研究對(duì)象的樣本內(nèi)基因離散率為0.6%-4.4%(血漿樣本)或0.5%-4.0%(全血樣本),血漿、全血樣本所得的樣本內(nèi)基因離散率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。夫妻間HIV的平均基因離散率為0.7%-5.1%(血漿樣本)或0.5%～6.8%(全血樣本)。(4)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析：每對(duì)夫妻的HIV準(zhǔn)種序列分別單獨(dú)聚集在一簇,伴有較高的bootstrap值(大于90),結(jié)合基因離散率,提示夫妻間存在傳播關(guān)系,并排除實(shí)驗(yàn)交叉污染的可能性。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可以顯示樣本間的并系關(guān)系進(jìn)而推斷傳播方向,除了第1對(duì)夫妻單獨(dú)分析血漿樣本以外,其他樣本在單獨(dú)分析血漿、全血樣本或混合分析2類樣本時(shí),均得到正確的傳播方向。夫妻2人感染時(shí)間的間隔越長(zhǎng),序列區(qū)分越清楚,如第2對(duì)夫妻感染時(shí)間相差8年以上,HIV序列各自聚集；而第1對(duì)夫妻感染時(shí)間接近(窗口期傳播),2人的多數(shù)序列互相交集。(5)樣本類型及抗病毒治療對(duì)結(jié)果分析的潛在影響：血漿樣本擴(kuò)增的是RNA中的目的片段,10/14份樣本擴(kuò)增成功；全血樣本擴(kuò)增的是前病毒DNA中的目的片段,全部擴(kuò)增成功。二者獲得的準(zhǔn)種群序列數(shù)量相當(dāng)。判斷傳播方向時(shí),4/5對(duì)夫妻的血漿樣本及7/7對(duì)夫妻的全血樣本可以準(zhǔn)確判定�？共《局委煹�5個(gè)研究對(duì)象中,血漿樣本只有2人擴(kuò)增成功,而全血樣本全部擴(kuò)增成功；全血、血漿樣本的Miseq測(cè)序結(jié)果都可以正確判斷傳播關(guān)系及傳播方向。第7對(duì)夫妻中的先感染者已進(jìn)行抗病毒治療57個(gè)月,也同樣能識(shí)別傳播關(guān)系及傳播方向。2、第1對(duì)夫妻隨訪樣本的分析結(jié)果(1)HIV準(zhǔn)種群分布：在后感染者F1的16份樣本中,血漿樣本8份Miseq測(cè)序成功,1份失��；全血樣本7份全部Miseq測(cè)序成功。先感染者M(jìn)l的11份樣本中,血漿、全血樣本全部擴(kuò)增成功。F1獲得的有效序列數(shù)如下：血漿樣本為83290～180118(平均131094)條,全血樣本為83329～175811(平均122444)條,分別代表23～322(平均125)個(gè)、12～190(平均67)個(gè)準(zhǔn)種群。M1獲得的有效序列數(shù)如下：血漿樣本為69949～172087(平均114462)條,全血樣本為75115～259369(平均166507)條,分別代表41～311(平均145)個(gè)、22～188(平均98)個(gè)準(zhǔn)種群。F1、M1血漿的準(zhǔn)種分布有隨時(shí)間逐漸分散的趨勢(shì),全血的準(zhǔn)種群分布變化規(guī)律不如血漿明顯。(2)基因離散率：隨訪樣本中的HIV準(zhǔn)種群的基因離散率隨著時(shí)間的推移均有逐漸增大的趨勢(shì),從感染后1月到37月,Fl樣本內(nèi)的平均基因離散率從0.7%(血漿)、0.6%(全血)增加到2.3%(血漿)、3.1%(全血),M1樣本內(nèi)的平均基因離散率從0.6%(血漿)、0.8%(全血)增加到0.7%(血漿)、2.7%(全血)。針對(duì)每個(gè)受檢者,不同時(shí)間隨訪采樣與第1次采樣之間的基因離散率也有不斷增加的趨勢(shì),F1在感染后3月及37月時(shí),樣本與第1次采樣(感染后1月)之間的平均基因離散率從0.9%(血漿)、0.6%(全血)增加到2.5%(血漿)、3.4%(全血),M1在感染后3月及37月時(shí),樣本與第1次采樣(感染后1月)之間的平均基因離散率從0.8%(血漿)、0.7%(全血)增加到4.1%(血漿)、3.2%(全血)。隨著時(shí)間的推進(jìn),夫妻間的基因離散率不斷增加,從感染后1月到37月,夫妻間的平均基因離散率從0.7%(血漿)、0.7%(全血)增加到5.4%(血漿)、4.7%(全血)。(3)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析：感染早期,各樣本的準(zhǔn)種群序列分布較為集中,樣本之間的準(zhǔn)種群序列分布也很接近,但隨著感染時(shí)間的推移,樣本內(nèi)的準(zhǔn)種群序列分布逐漸分散,各樣本之間的準(zhǔn)種群分布也逐漸遠(yuǎn)離。除了感染后12月的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)判定傳播方向錯(cuò)誤,其他樣本在單獨(dú)分析血漿、全血樣本或混合分析2類樣本時(shí),均得到正確的傳播方向。結(jié)論1、通過(guò)對(duì)7對(duì)婚內(nèi)性傳播HIV夫妻感染者的準(zhǔn)種傳播情況進(jìn)行分析,Miseq測(cè)序結(jié)果支持傳播關(guān)系及傳播方向的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果；抗病毒治療未影響傳播關(guān)系及傳播方向的判定。2、HIV準(zhǔn)種群的多樣性和頻數(shù)分布有助于了解HIV的傳播和進(jìn)化規(guī)律,全血樣本所得的HIV感染溯源分析結(jié)果比血漿樣本更可靠、更實(shí)用。3、隨著時(shí)間的推進(jìn),不同時(shí)間隨訪采樣與第1次采樣之間的基因離散率不斷增加,夫妻間的基因離散率也不斷增加。參照國(guó)外報(bào)道,感染后3年時(shí),隨訪采樣與第1次采樣之間的基因離散率可達(dá)到3%,傳染源與感染者之間的基因離散率可達(dá)到5%左右。4、對(duì)于傳播方向的判定,要考慮多種因素：(1)采樣距感染時(shí)間；時(shí)間越短,越容易判定,具體到多少年有待進(jìn)一步研究；(2)2個(gè)感染者的感染時(shí)間間隔；間隔越長(zhǎng)越容易判定,窗口期傳播在判定傳播方向時(shí)要特別慎重,尤其是采樣距傳播時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)。
【關(guān)鍵詞】：艾滋病 疾病傳播 分子流行病學(xué) 高通量測(cè)序技術(shù) 準(zhǔn)種群
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R512.91
【目錄】：

• 摘要5-9
• ABSTRACT9-14
• 前言14-17
• 研究對(duì)象17-19
• 主要設(shè)備、試劑及耗材19-21
• 實(shí)驗(yàn)方法21-34
• 結(jié)果34-47
• 討論47-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-54
• 附錄1 已發(fā)表論著54-59
• 附錄2 綜述59-67
• 參考文獻(xiàn)65-67
• 致謝67-69
• 個(gè)人簡(jiǎn)介69

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中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 陳嵩,王宇明;HCV準(zhǔn)種的結(jié)構(gòu)蛋白在真核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2003年10期

2 袁平戈;何謂準(zhǔn)種?有什么臨床意義?[J];中華肝臟病雜志;2003年07期

3 王齊欣,魏來(lái),高燕,孫德貴,蔣棟,徐小元,陳紅松,王宇;丙型肝炎病毒感染自然過(guò)程中的準(zhǔn)種變化[J];中華傳染病雜志;2004年05期

4 黃慧謙;張陽(yáng)德;王輝;陸堅(jiān);徐六妹;李麗雄;王火生;周伯平;;Ⅰ型人類免疫缺陷病毒的核酸異質(zhì)性及準(zhǔn)種特點(diǎn)的研究[J];中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2006年06期

5 王琦;成軍;;HBV準(zhǔn)種的研究進(jìn)展[J];診斷學(xué)理論與實(shí)踐;2008年01期

6 池肇春;;HBV準(zhǔn)種與耐藥相關(guān)性進(jìn)展[J];實(shí)用肝臟病雜志;2011年05期

7 彭曉謀,陳雪娟,謝冬英,高志良,彭文偉;丙型肝炎病毒感染個(gè)體的準(zhǔn)種源于感染過(guò)程中的病毒核酸突變[J];中華傳染病雜志;2000年03期

8 成軍;乙型肝炎病毒基因異質(zhì)性及準(zhǔn)種特點(diǎn)研究的臨床意義[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2002年02期

9 穆錦江;祁勇;;慢性丙型肝炎患者HCV準(zhǔn)種變異研究[J];哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2008年01期

10 田輝,王占英;HCV準(zhǔn)種與丙型肝炎慢性化[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊(cè));2002年02期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 朱研;譚朝霞;范焱;張長(zhǎng)江;王小紅;;丙型肝炎病毒動(dòng)態(tài)準(zhǔn)種優(yōu)勢(shì)株的確定[A];病毒性肝炎慢性化、重癥化基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)展學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

2 婁國(guó)強(qiáng);;HBV準(zhǔn)種單位-超感染模式的探索與研究[A];2005年浙江省感染病、肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2005年

3 黃素圓;于德敏;劉峰;龔啟明;韓悅;李新華;張欣欣;;乙型肝炎病毒感染者血清病毒全基因組準(zhǔn)種特征[A];第二屆全國(guó)病毒性肝炎慢性化重癥化基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)展學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2012年

4 楊之濤;黃素園;陳立;劉鋒;張欣欣;;乙型肝炎病毒感染不同臨床轉(zhuǎn)歸患者血清中病毒全長(zhǎng)基因組準(zhǔn)種特點(diǎn)[A];第7屆全國(guó)疑難及重癥肝病大會(huì)論文集[C];2013年

5 吳珍萍;韓濤;高英堂;杜智;劉彤;景麗;;核苷(酸)類似物抗病毒序貫治療中HBV準(zhǔn)種的演變[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第29屆學(xué)術(shù)年會(huì)暨首屆生物醫(yī)學(xué)工程前沿科學(xué)研討會(huì)論文集[C];2009年

6 劉映霞;胡國(guó)齡;譚德明;;乙型肝炎病毒S區(qū)準(zhǔn)種與疾病活動(dòng)性關(guān)系的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)感染病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2001年

7 韓悅;龔玲;張欣欣;;應(yīng)用超深度焦磷酸測(cè)序與基于傳統(tǒng)分子克隆測(cè)序技術(shù)分析乙型肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)準(zhǔn)種特征的比較研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十六次全國(guó)病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2013年

8 董菁;李進(jìn);施雙雙;皇甫競(jìng)坤;成軍;王勤環(huán);洪源;李莉;;乙型肝炎病毒基因組準(zhǔn)種與變異特點(diǎn)的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)感染病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2001年

9 劉霖;湯影子;王小紅;王宇明;;準(zhǔn)確反映乙型肝炎病毒準(zhǔn)種組成及分布方法的建立[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)全國(guó)第九次感染病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

10 陳嵩;王宇明;;一過(guò)性與持續(xù)性感染的丙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)區(qū)基因準(zhǔn)種的隨訪研究[A];重慶市預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2006年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前9條

1 蘭林;HBV準(zhǔn)種特性及其與干擾素治療關(guān)系的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2002年

2 陳嵩;丙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)區(qū)準(zhǔn)種的優(yōu)化篩選及其功能性蛋白的表達(dá)[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2002年

3 龔玲;超深焦磷酸測(cè)序分析HBV準(zhǔn)種異質(zhì)性及其與拉米夫定抗病毒治療應(yīng)答的關(guān)系[D];上海交通大學(xué);2014年

4 魯曉擘;新疆維吾爾族乙型肝炎病毒基因型分布、準(zhǔn)種特性及其生物學(xué)意義研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2007年

5 歐陽(yáng)雅博;HIV-1準(zhǔn)種變異對(duì)抗病毒治療效果的影響及其適應(yīng)性研究[D];中國(guó)疾病預(yù)防控制中心;2013年

6 黃廣宇;HIV-1準(zhǔn)種傳播的選擇性與免疫學(xué)表位以及細(xì)胞嗜性的關(guān)系研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2008年

7 王永剛;原位肝移植（OLT）前后HBV多聚酶（P）區(qū)準(zhǔn)種演變與其克隆型序列分析的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

8 孫崢嶸;HIV-1生物學(xué)特性及宿主遺傳背景與疾病進(jìn)展關(guān)系的研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2003年

9 張萍;HCV感染者免疫狀況、病毒基因變異與疾病轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性研究[D];浙江大學(xué);2004年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 溫玉潔;異性傳播HIV的準(zhǔn)種傳播和進(jìn)化規(guī)律研究[D];中國(guó)疾病預(yù)防控制中心;2015年

2 田輝;慢性丙型肝炎病人HCV準(zhǔn)種的變化及其意義[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2002年

3 何立華;HCV準(zhǔn)種變異特性及其免疫逃逸機(jī)制初步研究[D];昆明理工大學(xué);2011年

4 王鵬;慢加急性肝衰竭患者中乙型肝炎病毒S區(qū)基因準(zhǔn)種與疾病關(guān)系的研究[D];蚌埠醫(yī)學(xué)院;2013年

5 王昊;我國(guó)甲肝病毒流行株全基因組序列分析及準(zhǔn)種變異研究[D];中國(guó)疾病預(yù)防控制中心;2014年

6 劉霖;一例慢性乙型肝炎重型化患者血清HBV準(zhǔn)種的動(dòng)力學(xué)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

7 馬其歡;基于深度測(cè)序從全基因組分析母子患者血清HBV準(zhǔn)種多態(tài)性[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2013年

8 丁花花;乙型肝炎病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)準(zhǔn)種特性分析及耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異觀察[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2012年

9 賈鐵留;丙型肝炎病毒HVR1區(qū)準(zhǔn)種的研究[D];昆明理工大學(xué);2006年

10 朱研;基于HCV 6Kb擴(kuò)增子的動(dòng)態(tài)準(zhǔn)種優(yōu)勢(shì)株的確定及包膜2基因正選擇位點(diǎn)分析[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2010年

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本文編號(hào)：953154