本文關(guān)鍵詞：基于ITS基因的PCR檢測(cè)人糞中鉤蟲(chóng)卵的應(yīng)用研究

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【摘要】：【研究目的】鉤蟲(chóng)感染目前仍然在中低等收入的熱帶和亞熱帶國(guó)家流行,對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)和公眾健康具有廣泛影響。在世界上許多經(jīng)濟(jì)貧困和發(fā)展滯后的偏遠(yuǎn)農(nóng)村地區(qū),鉤蟲(chóng)病仍是一個(gè)亟待解決的公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前鏡檢法對(duì)于鉤蟲(chóng)種的檢測(cè)鑒定耗時(shí)、費(fèi)力且缺乏準(zhǔn)確性,因此,開(kāi)發(fā)準(zhǔn)確快速的檢測(cè)和鑒定感染人體鉤蟲(chóng)種的方法具有重要的實(shí)用價(jià)值。本課題提取人糞便樣本中的鉤蟲(chóng)卵基因組DNA,利用半巢式PCR技術(shù)對(duì)感染人體的鉤蟲(chóng)種進(jìn)行檢測(cè)分類(lèi),通過(guò)與鏡檢法比較,評(píng)價(jià)其檢測(cè)效果。【研究方法】(1)糞便樣本的采集:現(xiàn)場(chǎng)采集西雙版納傣族自治州景洪市和勐�？h多所小學(xué)五年級(jí)學(xué)生的糞便樣本,以及普洱市江城縣多所小學(xué)三至五年級(jí)學(xué)生的糞便樣本,采用改良加藤法對(duì)每份糞便進(jìn)行“一糞三檢”,經(jīng)鏡檢確定寄生蟲(chóng)蟲(chóng)卵類(lèi)型同時(shí)進(jìn)行分類(lèi)計(jì)數(shù),篩選出含有鉤蟲(chóng)卵的樣本共66份(其中部分樣本同時(shí)伴有蛔蟲(chóng)、鞭蟲(chóng)、絳蟲(chóng)的感染),隨機(jī)挑選20份不含鉤蟲(chóng)卵(部分含蛔蟲(chóng)、鞭蟲(chóng)卵)的糞便樣本作為陰性對(duì)照。將樣本置于盛有95%乙醇的5ml凍存管中,做好標(biāo)記,于4℃冰箱保存并帶回實(shí)驗(yàn)室,準(zhǔn)備進(jìn)行下一步檢測(cè)。(2)PCR方法的應(yīng)用:采用半巢式PCR方法擴(kuò)增所采集糞便樣本中鉤蟲(chóng)卵核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(the second internal transcribed spacer,ITS2)和28S RNA序列來(lái)對(duì)鉤蟲(chóng)種進(jìn)行檢測(cè)鑒定。經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳判斷結(jié)果后,選擇部分陽(yáng)性PCR產(chǎn)物測(cè)序,測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)進(jìn)一步確定基因類(lèi)型。同時(shí)對(duì)DNA的提取方法進(jìn)行改進(jìn),對(duì)PCR非特異性擴(kuò)增的消除方法進(jìn)行探索,采用倍比稀釋法檢測(cè)半巢式PCR的靈敏度�！窘Y(jié)果】鏡檢鉤蟲(chóng)卵陽(yáng)性的66份糞便樣本中,經(jīng)DNA提取方法的改進(jìn)后,PCR檢測(cè)的敏感性由62.12%(41/66)提升至96.97%(64/66)。本研究發(fā)現(xiàn)在云南省南部地區(qū)美洲鉤蟲(chóng)98.43%(63/64)是感染人類(lèi)的優(yōu)勢(shì)鉤蟲(chóng)種,其次是錫蘭鉤蟲(chóng)1.56%(1/64),未檢測(cè)到十二指腸鉤蟲(chóng)的感染。本研究未檢測(cè)到其他蟲(chóng)種,特異性為100%,與鏡檢的一致率為97.67%,說(shuō)明兩種檢測(cè)方法一致性較好。靈敏度檢測(cè)結(jié)果表明該檢測(cè)方法的檢測(cè)下限為稀釋256倍的DNA原液,即每克糞便含約4個(gè)鉤蟲(chóng)卵�！窘Y(jié)論】1.本研究表明:通過(guò)方法改進(jìn),此半巢式PCR方法具有準(zhǔn)確、快速、靈敏、特異性高的優(yōu)點(diǎn),可直接用于檢測(cè)及鑒定人糞中的鉤蟲(chóng)卵,是一種有實(shí)用價(jià)值的流行病學(xué)調(diào)查工具。2.本研究證實(shí)經(jīng)過(guò)研磨的方法改進(jìn),促進(jìn)了鉤蟲(chóng)卵卵殼和卵膜的破裂,提高了蟲(chóng)卵DNA提取的成功率。3.降低外側(cè)引物的濃度可以消除PCR的非特異性擴(kuò)增。4.本研究再次檢測(cè)到錫蘭鉤蟲(chóng)的感染,提示該鉤蟲(chóng)病存在人獸之間相互感染的風(fēng)險(xiǎn)。
【關(guān)鍵詞】：半巢式PCR ITS基因 檢測(cè) 鉤蟲(chóng) 糞便樣本
【學(xué)位授予單位】：大理大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R532.12
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 符號(hào)表9-10
• 第一章 前言10-23
• 一、鉤蟲(chóng)概述10-12
• 二、鉤蟲(chóng)的檢測(cè)鑒定方法12-21
• 三、鉤蟲(chóng)ITS序列特征及其在研究中的應(yīng)用21
• 四、研究目的與意義21-23
• 第二章 運(yùn)用基于ITS基因的PCR方法檢測(cè)人糞中的鉤蟲(chóng)卵23-45
• 一、材料與方法23-32
• 1.實(shí)驗(yàn)材料23-25
• 2.實(shí)驗(yàn)方法25-32
• 二、結(jié)果32-45
• 第三章 討論45-49
• 第四章 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-55
• 附錄一55-56
• 綜述56-70
• 參考文獻(xiàn)65-70
• 致謝70

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中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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本文編號(hào)：952325