本文關(guān)鍵詞：基于ITS基因的PCR檢測人糞中鉤蟲卵的應(yīng)用研究

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【摘要】：【研究目的】鉤蟲感染目前仍然在中低等收入的熱帶和亞熱帶國家流行,對社會經(jīng)濟和公眾健康具有廣泛影響。在世界上許多經(jīng)濟貧困和發(fā)展滯后的偏遠農(nóng)村地區(qū),鉤蟲病仍是一個亟待解決的公共衛(wèi)生問題。目前鏡檢法對于鉤蟲種的檢測鑒定耗時、費力且缺乏準確性,因此,開發(fā)準確快速的檢測和鑒定感染人體鉤蟲種的方法具有重要的實用價值。本課題提取人糞便樣本中的鉤蟲卵基因組DNA,利用半巢式PCR技術(shù)對感染人體的鉤蟲種進行檢測分類,通過與鏡檢法比較,評價其檢測效果�！狙芯糠椒ā�(1)糞便樣本的采集:現(xiàn)場采集西雙版納傣族自治州景洪市和勐海縣多所小學(xué)五年級學(xué)生的糞便樣本,以及普洱市江城縣多所小學(xué)三至五年級學(xué)生的糞便樣本,采用改良加藤法對每份糞便進行“一糞三檢”,經(jīng)鏡檢確定寄生蟲蟲卵類型同時進行分類計數(shù),篩選出含有鉤蟲卵的樣本共66份(其中部分樣本同時伴有蛔蟲、鞭蟲、絳蟲的感染),隨機挑選20份不含鉤蟲卵(部分含蛔蟲、鞭蟲卵)的糞便樣本作為陰性對照。將樣本置于盛有95%乙醇的5ml凍存管中,做好標記,于4℃冰箱保存并帶回實驗室,準備進行下一步檢測。(2)PCR方法的應(yīng)用:采用半巢式PCR方法擴增所采集糞便樣本中鉤蟲卵核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(the second internal transcribed spacer,ITS2)和28S RNA序列來對鉤蟲種進行檢測鑒定。經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳判斷結(jié)果后,選擇部分陽性PCR產(chǎn)物測序,測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對進一步確定基因類型。同時對DNA的提取方法進行改進,對PCR非特異性擴增的消除方法進行探索,采用倍比稀釋法檢測半巢式PCR的靈敏度�！窘Y(jié)果】鏡檢鉤蟲卵陽性的66份糞便樣本中,經(jīng)DNA提取方法的改進后,PCR檢測的敏感性由62.12%(41/66)提升至96.97%(64/66)。本研究發(fā)現(xiàn)在云南省南部地區(qū)美洲鉤蟲98.43%(63/64)是感染人類的優(yōu)勢鉤蟲種,其次是錫蘭鉤蟲1.56%(1/64),未檢測到十二指腸鉤蟲的感染。本研究未檢測到其他蟲種,特異性為100%,與鏡檢的一致率為97.67%,說明兩種檢測方法一致性較好。靈敏度檢測結(jié)果表明該檢測方法的檢測下限為稀釋256倍的DNA原液,即每克糞便含約4個鉤蟲卵�！窘Y(jié)論】1.本研究表明:通過方法改進,此半巢式PCR方法具有準確、快速、靈敏、特異性高的優(yōu)點,可直接用于檢測及鑒定人糞中的鉤蟲卵,是一種有實用價值的流行病學(xué)調(diào)查工具。2.本研究證實經(jīng)過研磨的方法改進,促進了鉤蟲卵卵殼和卵膜的破裂,提高了蟲卵DNA提取的成功率。3.降低外側(cè)引物的濃度可以消除PCR的非特異性擴增。4.本研究再次檢測到錫蘭鉤蟲的感染,提示該鉤蟲病存在人獸之間相互感染的風(fēng)險。
【關(guān)鍵詞】：半巢式PCR ITS基因 檢測 鉤蟲 糞便樣本
【學(xué)位授予單位】：大理大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R532.12
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 符號表9-10
• 第一章 前言10-23
• 一、鉤蟲概述10-12
• 二、鉤蟲的檢測鑒定方法12-21
• 三、鉤蟲ITS序列特征及其在研究中的應(yīng)用21
• 四、研究目的與意義21-23
• 第二章 運用基于ITS基因的PCR方法檢測人糞中的鉤蟲卵23-45
• 一、材料與方法23-32
• 1.實驗材料23-25
• 2.實驗方法25-32
• 二、結(jié)果32-45
• 第三章 討論45-49
• 第四章 結(jié)論49-50
• 參考文獻50-55
• 附錄一55-56
• 綜述56-70
• 參考文獻65-70
• 致謝70

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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10 劉兆潔;黃仕P，

本文編號：952325