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登革病毒包膜EDⅢ蛋白中和抗體結(jié)合表位篩選與鑒定

發(fā)布時(shí)間：2017-09-26 14:05

本文關(guān)鍵詞：登革病毒包膜EDⅢ蛋白中和抗體結(jié)合表位篩選與鑒定

【摘要】：登革熱(Dengue fever,DF)是由登革病毒(Dengue virus,DENV)感染所引起的一種蟲(chóng)媒傳染性疾病,輕者主要引起無(wú)癥狀感染或者產(chǎn)生輕微的癥狀,嚴(yán)重者可導(dǎo)致發(fā)生登革出血熱(Dengue hemorrhagic fever,DHF)和登革休克綜合征(Dengue shock syndrome,DSS)。WHO2014年2月發(fā)布的報(bào)告稱(chēng)登革熱為全球蔓延最快的病媒傳播疾病,發(fā)病數(shù)量在過(guò)去50年間增加了約30倍。已構(gòu)成美洲、東南亞、西太平洋地區(qū)的嚴(yán)重的健康問(wèn)題和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。2014年,登革熱在我國(guó)南方(主要是廣東省)再次發(fā)生大流行,僅廣東省累積報(bào)告登革熱病例超過(guò)45000例,再次敲響了防治登革熱的警鐘。在目前尚無(wú)登革特異性治療藥物批準(zhǔn)的情況下,登革疫苗的研發(fā)愈發(fā)重要。目前有數(shù)個(gè)登革疫苗正在進(jìn)行臨床試驗(yàn),僅有一種疫苗通過(guò)Ⅲ期臨床試驗(yàn),但此疫苗對(duì)不同血清型登革病毒保護(hù)性差異較大,尤其對(duì)2型登革病毒幾乎無(wú)保護(hù)作用。鑒于登革病毒多種血清型及其致病機(jī)制的復(fù)雜性,尤其二次感染異型登革病毒所產(chǎn)生的抗體增強(qiáng)作用(ADE)更是成為疫苗研發(fā)的重要掣肘。登革病毒屬于黃病毒家族,為有包膜的單正鏈RNA病毒,包括四種不同的血清型,基因組長(zhǎng)度約llkb,編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白(C,衣殼蛋白；M,膜蛋白；E,包膜蛋白)及7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。其中,由于E蛋白暴露在病毒表面,是誘導(dǎo)登革病毒中和抗體產(chǎn)生的主要蛋白,也是與疫苗研究相關(guān)的主要蛋白；非結(jié)構(gòu)蛋白參與登革病毒生活周期的重要環(huán)節(jié),相關(guān)研究主要用于體外診斷試劑的研發(fā)上。E蛋白含有3個(gè)功能區(qū),I區(qū)(EDI)位于中心；Ⅱ區(qū)(EDⅡ)位于側(cè)面,含融合環(huán)；Ⅲ區(qū)(EDⅢ)呈免疫球蛋白樣折疊,被認(rèn)為能夠與細(xì)胞表面受體結(jié)合及中和抗體的主要靶點(diǎn),登革熱疫苗研究的靶標(biāo)也多集中于EDⅢ蛋白。研究表明,從感染登革病毒患者體內(nèi)分離的登革病毒抗體中含有交叉反應(yīng)性及型特異性EDⅢ抗體,且抗登革病毒諸多成分的抗體中,EDⅢ抗體在Vero細(xì)胞感染模型中具有最強(qiáng)的中和活性。重組EDⅢ蛋白鼠源單抗亦具有體內(nèi)外中和作用。已經(jīng)證實(shí)去除登革病毒感染患者恢復(fù)期血清中EDⅢ抗體并不改變?cè)撗宓闹泻妥饔眉癆DE作用,可能原因?yàn)榛颊哐逯锌笶DⅢ抗體含量低,在整個(gè)血清保護(hù)作用中占的比例較低。但是如能夠促進(jìn)患者體內(nèi)EDⅢ抗體的產(chǎn)生并達(dá)到有效濃度,EDⅢ抗體很可能具有強(qiáng)大的中和保護(hù)作用,因而具備作為治療性抗體的潛能。而患者體內(nèi)EDⅢ抗體產(chǎn)生較少的直接原因可能是作為登革病毒多種抗原成份之一的EDⅢ蛋白在自然感染的抗原競(jìng)爭(zhēng)中處于劣勢(shì),從而不能誘導(dǎo)有效的抗體反應(yīng)。因此解析EDⅢ蛋白中和表位,進(jìn)而制備亞單位疫苗避免多種成份的抗原競(jìng)爭(zhēng)仍是重要的疫苗研發(fā)策略,亦是本研究的切入點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)室前期工作中,用DENV1-4 EDⅢ重組蛋白免疫小鼠制備了一批EDⅢ蛋白鼠源性單克隆抗體,并用免疫學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行了鑒定。本研究的思路是,在與四種血清型EDⅢ蛋白均發(fā)生交叉反應(yīng)的單抗中,以體外微中和實(shí)驗(yàn)方法(Enzyme-linked immune spot-based micro-neutralization test, ELISPOT-MNT),鑒定出2株單抗對(duì)不同血清型登革病毒具有較好的體外中和作用,單抗克隆號(hào)為2811A35和2D73A7,再?gòu)氖删w展示肽庫(kù)中篩選其可能的抗原結(jié)合表位,尋找具有四型登革病毒交叉保護(hù)性抗體結(jié)合EDⅢ蛋白的表位特征,并為進(jìn)一步探索其結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系提供參考。一、登革病毒EDⅢ蛋白單克隆抗體交叉中和活性的鑒定由于登革病毒多種血清型及致病機(jī)制的復(fù)雜性,理想的疫苗應(yīng)誘導(dǎo)出針對(duì)四種登革血清型的交叉中和抗體,理想的靶點(diǎn)為存在于4種血清型病毒的保守表位,因此本部分內(nèi)容旨在尋找對(duì)四種血清型登革病毒具交叉保護(hù)作用的單抗。我們從實(shí)驗(yàn)室前期制備的27株能與四種血清型登革病毒EDⅢ蛋白反應(yīng)的交叉反應(yīng)性單抗中,運(yùn)用ELISPOT-MNT微中和實(shí)驗(yàn)方法,鑒定出2株對(duì)不同血清型登革病毒具有較好保護(hù)作用的單抗。本章工作將單抗分別與四種血清型登革病毒孵育后感染LLC-MK2細(xì)胞,通過(guò)斑點(diǎn)顯色的方法,檢測(cè)并計(jì)數(shù)被感染細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果顯示單抗與病毒孵育后能明顯降低病毒對(duì)細(xì)胞的感染,隨著單抗?jié)舛鹊脑黾?被感染的細(xì)胞數(shù)明顯減少,直到能完全保護(hù)細(xì)胞不被感染。其中,單抗2B11A35對(duì)1、2、3型登革病毒有較好的中和活性,50%抑制濃度(IC50)均小于1.5μg/ml,但是對(duì)4型登革病毒中和活性較差,IC5080μg/ml;單抗2D73A7對(duì)2、3型登革病毒有較好的中和活性,IC503.5μg/ml,對(duì)4型登革病毒中和活性次之,IC508μg/ml,對(duì)1型登革病毒的中和活性最差,IC50200μg/ml。本部分內(nèi)容鑒定出兩株具有交叉保護(hù)作用的單克隆抗體,這兩株單抗對(duì)不同血清型登革病毒具有明確的中和作用。理論上,具有交叉中和作用的單抗結(jié)合的應(yīng)該是存在于不同血清型登革病毒EDⅢ蛋白上的保守表位,交叉中和單抗結(jié)合EDⅢ蛋白表位特征值得進(jìn)一步研究。二、單抗2B11A35和2D73A7結(jié)合表位的篩選與鑒定用交叉中和單抗2B11A35和2D73A7分別從噬菌體隨機(jī)展示線(xiàn)性12肽庫(kù)(linear dodecapeptide phage display libraries,Ph.D.-12)和噬菌體隨機(jī)展示環(huán)狀7肽庫(kù)(loop-constrained heptapeptide phage display libraries, Ph.D.-C7C)中篩選與單抗特異性結(jié)合的噬菌體克隆。用單抗2B11A35對(duì)線(xiàn)性肽庫(kù)(Ph.D.-12)進(jìn)行了3輪淘選,噬菌體滴度富集了7500倍,從第三輪洗脫產(chǎn)物中挑選了20個(gè)噬菌體克隆；用單抗2B11A35對(duì)環(huán)7肽庫(kù)(Ph.D.-C7C)進(jìn)行了3輪淘選,噬菌體滴度富集了673倍,從第三輪洗脫產(chǎn)物中挑選了20個(gè)噬菌體克�。挥脝慰�2D73A7對(duì)Ph.D.-12對(duì)進(jìn)行了3輪淘選,噬菌體滴度富集了5396倍,從第三輪洗脫產(chǎn)物中挑選了30個(gè)噬菌體克�。挥脝慰�2D73A7對(duì)Ph.D.-C7C進(jìn)行了4輪淘選,噬菌體滴度富集了5111倍,從第四輪洗脫產(chǎn)物中挑選了20個(gè)噬菌體克隆。采用結(jié)合ELISA鑒定單抗與噬菌體克隆結(jié)合情況,結(jié)果獲得17個(gè)與單抗2B11A35特異性結(jié)合的Ph.D.-12克隆,20個(gè)Ph.D.-C7C克隆；26個(gè)結(jié)合單抗2D73A7的Ph.D.-12克隆和18個(gè)Ph.D.-C7C克隆。所有陽(yáng)性克隆均排除了吸板序列的可能性,且與無(wú)關(guān)單抗不結(jié)合。對(duì)所獲陽(yáng)性克隆分別進(jìn)行擴(kuò)增、DNA提取并全部送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。單抗2B11A35篩選的17個(gè)Ph.D.-12克隆中重復(fù)性最高的序列分別為T(mén)HNGPGRFTGIL、THYCAWDQKNCL和THQPQPKIPAVT;20個(gè)Ph.D.-C7C克隆中重復(fù)性最高的序列WHGHPHH和GHDLHPA。單抗2D73A7篩選到的26個(gè)Ph.D.-12克隆中重復(fù)性最高的序列分別為L(zhǎng)HRYSPDGASYA和LHRYDVSNNLPN;18個(gè)Ph.D.-C7C克隆中重復(fù)性最高的序列PMYGWDM和WAYGFNM。表位預(yù)測(cè)結(jié)果表明兩株單抗結(jié)合EDIII蛋白構(gòu)象表位,且兩株單抗結(jié)合表位在EDIII蛋白上有重疊,但跨度不同。結(jié)合前期ELISA鑒定結(jié)果及測(cè)序分析,將單抗2B11A35篩選的Ph.D.-12中含重復(fù)性較高,且ELISA結(jié)果顯示結(jié)合特異性較好的序列進(jìn)行化學(xué)合成。最終選出4個(gè)線(xiàn)性12肽序列,分別為No.1 HSTHNGPGRFTGILGG,No.9 HSYSLEPTHRNHNHGG, No.11 HSHDARYHLHLKPTGG, No.14 HSTHQPQPKIPAVTGG.因合成肽的N端偶聯(lián)有生物素,合成肽抗原性的鑒定采用了四種不同ELISA實(shí)驗(yàn)方案,結(jié)果四種實(shí)驗(yàn)方案均無(wú)法檢測(cè)到單抗與合成肽的結(jié)合,且將合成肽與卵清白蛋白(ovalbumin, OVA)偶聯(lián)后與單抗亦不結(jié)合。究其原因主要是構(gòu)象性表位短肽難以通過(guò)合成表達(dá)可展示在噬菌體表面上的抗原性。三、噬菌體免疫小鼠評(píng)價(jià)篩選模擬肽的免疫原性將單抗2B11A35篩選Ph.D.-12得到的1、9、11、14號(hào)噬菌體克隆進(jìn)行擴(kuò)增并純化,以1012pfu/ml與弗氏佐劑乳化后免疫免疫BALB/C小鼠,同時(shí)用空載體噬菌體免疫作為對(duì)照。三輪免疫后,收獲的小鼠抗血清可與噬菌體結(jié)合,血清效價(jià)約為800,同時(shí)免疫小鼠血清也能與1、3、4型DENV EDⅢ蛋白及2型登革病毒感染Vero細(xì)胞特異性結(jié)合。結(jié)果表明所篩選的噬菌體展示肽能夠模擬DENV EDⅢ蛋白上單抗2B11A35識(shí)別的表位,能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)4種血清型登革病毒的交叉抗體反應(yīng),提示上述序列模擬了存在于不同血清型登革病毒EDⅢ蛋白的保守表位,且均為構(gòu)象性表位。
【關(guān)鍵詞】：登革病毒 包膜蛋白3 交叉中和抗體 噬菌體展示肽庫(kù) 構(gòu)象性表位
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R512.8;R446.6
【目錄】：