發(fā)布時(shí)間：2017-09-25 22:39

  本文關(guān)鍵詞：乙型肝炎病毒X蛋白通過(guò)CDC42蛋白誘發(fā)Huh7細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： HBx CDC42 IQGAP1 細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化 定量蛋白質(zhì)組學(xué)

【摘要】：肝細(xì)胞癌是世界第五大流行癌癥,致死率非常高。慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染被認(rèn)為是誘發(fā)肝癌的主要因素。研究發(fā)現(xiàn)HBV基因組x基因編碼的X蛋白(hepatitsis B virus X protein, HBx)在HBV復(fù)制和誘發(fā)肝癌過(guò)程中具有重要作用。課題組前期對(duì)HBx轉(zhuǎn)基因小鼠SILAC (Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture)定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),在HBx誘發(fā)小鼠肝臟由重度炎癥轉(zhuǎn)變?yōu)榘┌Y過(guò)程中,CDC42信號(hào)通路相關(guān)分子及CDC42蛋白本身蛋白表達(dá)量上調(diào),提示在HBx誘發(fā)小鼠肝癌過(guò)程中,CDC42信號(hào)通路被激活。激活的CDC42可參與多條信號(hào)通路,引起細(xì)胞骨架、細(xì)胞周期、細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力等改變。為了解CDC42蛋白是否參與以及如何參與HBx介導(dǎo)的Huh7細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,本研究首先通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)Huh7-HBx細(xì)胞中的CDC42基因進(jìn)行修飾,而后通過(guò)添加CDC42特異性抑制劑CASIN抑制Huh7-mock細(xì)胞和Huh7-HBx細(xì)胞中CDC42活性,探究CDC42功能破壞時(shí)HBx介導(dǎo)的Huh7惡性轉(zhuǎn)化程度變化,進(jìn)而揭示CDC42在HBx誘發(fā)人肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用。研究結(jié)果將為深入理解HBV致癌機(jī)制、尋找HBV相關(guān)肝癌的治療靶標(biāo)提供理論依據(jù)。具體研究結(jié)果如下：1.HBx介導(dǎo)Huh7細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化為了解HBx基因的異常表達(dá)是否可引起人肝癌細(xì)胞系Huh7細(xì)胞系的惡性轉(zhuǎn)化,首先應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Huh7-mock細(xì)胞和Huh7-HBx細(xì)胞中HBx基因表達(dá)情況,采用CCK-8試劑盒檢測(cè)2種細(xì)胞的增殖能力、Annex V和FITC試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平,并通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HBx基因轉(zhuǎn)染前后Huh7細(xì)胞遷移能力的變化情況。結(jié)果顯示：(1)Huh7-HBx細(xì)胞中HBx基因的表達(dá)顯著高于Huh7-mock細(xì)胞(p0.01)；(2)Huh7-HBx細(xì)胞的增殖能力顯著高于Huh7-mock細(xì)胞(p0.01)；(3)Huh7-HBx細(xì)胞的抗凋亡能力顯著高于Huh7-mock細(xì)胞(流式細(xì)胞儀分析)。(4)Huh7-HBx細(xì)胞的遷移能力高于Huh7-mock細(xì)胞；(5)與Huh7-mock細(xì)胞相目比,Huh7-HBx細(xì)胞中CDC42蛋白表達(dá)量升高(Western blot分析)。2.HBx介導(dǎo)Huh7細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化依賴CDC42為了驗(yàn)證CDC42蛋白是否參與HBx介導(dǎo)的Huh7細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,首先應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)Huh7-HBx細(xì)胞中CDC42基因進(jìn)行編輯,檢測(cè)CDC42基因敲除前后細(xì)胞的增殖能力、凋亡水平及遷移能力,而后采用CDC42蛋白特異性抑制劑CASIN處理Huh7-mock細(xì)胞和Huh7-HBx細(xì)胞,了解其對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)獲得在CDC42基因第二外顯子處具有4個(gè)堿基缺失的突變體細(xì)胞(Huh7-HBx CDC42 KO);(2)Huh7-HBx CDC42 KO細(xì)胞增殖能力顯著低于Huh7-HBx細(xì)胞(p0.01)；(3)Huh7-HBx CDC42 KO細(xì)胞群體中晚期凋亡細(xì)胞比例升高,即細(xì)胞抗凋亡能力顯著下降；(4)Huh7-HBx CDC42 KO細(xì)胞的遷移能力低于Huh7-HBx細(xì)胞；(5)不同濃度CASIN處理一定時(shí)間后,Huh7-HBx細(xì)胞的增殖能力顯著降低(p0.01),而Huh7細(xì)胞的增殖能力沒(méi)有顯著變化；Huh7-HBx細(xì)胞的抗凋亡能力顯著下降(pO.01),而Huh7細(xì)胞抗凋亡能力在抑制劑處理前后沒(méi)有顯著變化。3.CDC42參與HBx介導(dǎo)Huh7細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的定量蛋白質(zhì)組研究為了鑒定參與HBx介導(dǎo)Huh7細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的CDC42蛋白下游效應(yīng)因子,利用基于質(zhì)量虧損的準(zhǔn)等重二甲基標(biāo)記技術(shù)分別對(duì)Huh7-mock細(xì)胞和Huh7-HBx細(xì)胞的全蛋白在肽段水平進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記,混合后的肽段經(jīng)離線液相分離,Q Exactive HF質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè),pFind3.0搜索引擎處理數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示：(1)在Huh7-HBx(30L)和Huh7-HBx CDC42 KO (30H)組數(shù)據(jù)中,共定量到4436個(gè)蛋白,其中差異蛋白為523個(gè),上調(diào)蛋白為239個(gè),下調(diào)蛋白共284個(gè)；(2)下調(diào)蛋白的功能主要聚集在細(xì)胞死亡、細(xì)胞凋亡等途徑；(3)IQGAP1蛋白作為CDC42的下游效應(yīng)因子可能參與了HBx介導(dǎo)的Huh7細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。以上研究結(jié)果表明,HBx進(jìn)入Huh7細(xì)胞后,通過(guò)調(diào)控CDC42蛋白活性,使其與IQGAP1結(jié)合,導(dǎo)致Huh7細(xì)胞的分裂、增殖等生命活動(dòng)發(fā)生紊亂,最終導(dǎo)致了Huh7細(xì)胞惡性化程度的升高。本研究結(jié)果提示HBx/CDC42/IQGAP1信號(hào)通路在HBx誘發(fā)肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中可能具有重要作用,也許是HBV致癌的一種新機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：HBx CDC42 IQGAP1 細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化 定量蛋白質(zhì)組學(xué)
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R512.62;R735.7
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-13
• 中英文縮略詞表13-15
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述15-24
• 第一章 乙型肝炎病毒X蛋白在肝細(xì)胞癌中的作用研究進(jìn)展16-20
• 1. HBx與HBV基因組的復(fù)制與表達(dá)16-17
• 2. HBx與肝細(xì)胞癌17
• 3. HBx與細(xì)胞凋亡17-19
• 3.1 HBx促進(jìn)細(xì)胞凋亡18
• 3.2 HBx抑制細(xì)胞凋亡18-19
• 4. HBx與肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化19-20
• 第二章 CDC42在癌癥中作用的研究進(jìn)展20-22
• 1. CDC42與細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移20-21
• 2. CDC42與細(xì)胞極性21-22
• 3. CDC42在癌癥中的作用22
• 目的及意義22-24
• 第二篇 研究?jī)?nèi)容24-60
• 第一章 HBx基因介導(dǎo)人肝癌細(xì)胞系Huh7細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化25-35
• 前言25
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料與方法25-31
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料25-28
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法28-31
• 2. 結(jié)果與分析31-33
• 2.1 HBx基因在Huh7細(xì)胞中的表達(dá)水平31
• 2.2 HBx介導(dǎo)Huh7細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化31-33
• 3. 討論33-34
• 4. 小結(jié)34-35
• 第二章 HBx介導(dǎo)的Huh7細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化依賴CDC42蛋白35-50
• 前言35
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料與方法35-42
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料35-36
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法36-42
• 2. 結(jié)果與分析42-48
• 2.1 gRNA與CRISPR/Cas9載體連接42
• 2.2 gRNA內(nèi)源活性檢測(cè)42-44
• 2.3 單克隆分選與鑒定44
• 2.4 CDC42基因敲除對(duì)Huh7-HBx細(xì)胞表型的影響44-46
• 2.5 CDC42蛋白活性在HBx介導(dǎo)Huh7惡性轉(zhuǎn)化中的作用46-48
• 3. 討論48-49
• 4. 小結(jié)49-50
• 第三章 CDC42參與HBx介導(dǎo)的肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的定量蛋白組學(xué)研究50-60
• 前言50
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料與方法50-54
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料50-51
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法51-54
• 2. 結(jié)果與分析54-58
• 2.1 質(zhì)譜樣品的制備54-55
• 2.2 二甲基化標(biāo)記效率分析55
• 2.3 定量蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析55-56
• 2.4 CDC42下游蛋白IQGAP1蛋白表達(dá)下調(diào)56-58
• 3. 討論58-59
• 4. 小結(jié)59-60
• 全文總結(jié)60-61
• 參考文獻(xiàn)61-70
• 附表70-83
• 致謝83-85
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文85

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1 張?zhí)锟?細(xì)胞調(diào)亡的意義[N];中國(guó)人口報(bào);2002年

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本文編號(hào)：920020