本文關鍵詞：乙型肝炎病毒X蛋白通過CDC42蛋白誘發(fā)Huh7細胞惡性轉化的機制研究

  更多相關文章： HBx CDC42 IQGAP1 細胞惡性轉化 定量蛋白質組學

【摘要】：肝細胞癌是世界第五大流行癌癥,致死率非常高。慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染被認為是誘發(fā)肝癌的主要因素。研究發(fā)現(xiàn)HBV基因組x基因編碼的X蛋白(hepatitsis B virus X protein, HBx)在HBV復制和誘發(fā)肝癌過程中具有重要作用。課題組前期對HBx轉基因小鼠SILAC (Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture)定量蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn),在HBx誘發(fā)小鼠肝臟由重度炎癥轉變?yōu)榘┌Y過程中,CDC42信號通路相關分子及CDC42蛋白本身蛋白表達量上調,提示在HBx誘發(fā)小鼠肝癌過程中,CDC42信號通路被激活。激活的CDC42可參與多條信號通路,引起細胞骨架、細胞周期、細胞侵襲轉移能力等改變。為了解CDC42蛋白是否參與以及如何參與HBx介導的Huh7細胞惡性轉化,本研究首先通過CRISPR/Cas9技術對Huh7-HBx細胞中的CDC42基因進行修飾,而后通過添加CDC42特異性抑制劑CASIN抑制Huh7-mock細胞和Huh7-HBx細胞中CDC42活性,探究CDC42功能破壞時HBx介導的Huh7惡性轉化程度變化,進而揭示CDC42在HBx誘發(fā)人肝細胞惡性轉化中的作用。研究結果將為深入理解HBV致癌機制、尋找HBV相關肝癌的治療靶標提供理論依據。具體研究結果如下：1.HBx介導Huh7細胞惡性轉化為了解HBx基因的異常表達是否可引起人肝癌細胞系Huh7細胞系的惡性轉化,首先應用實時定量PCR檢測Huh7-mock細胞和Huh7-HBx細胞中HBx基因表達情況,采用CCK-8試劑盒檢測2種細胞的增殖能力、Annex V和FITC試劑盒檢測細胞凋亡水平,并通過細胞劃痕實驗檢測HBx基因轉染前后Huh7細胞遷移能力的變化情況。結果顯示：(1)Huh7-HBx細胞中HBx基因的表達顯著高于Huh7-mock細胞(p0.01)；(2)Huh7-HBx細胞的增殖能力顯著高于Huh7-mock細胞(p0.01)；(3)Huh7-HBx細胞的抗凋亡能力顯著高于Huh7-mock細胞(流式細胞儀分析)。(4)Huh7-HBx細胞的遷移能力高于Huh7-mock細胞；(5)與Huh7-mock細胞相目比,Huh7-HBx細胞中CDC42蛋白表達量升高(Western blot分析)。2.HBx介導Huh7細胞惡性轉化依賴CDC42為了驗證CDC42蛋白是否參與HBx介導的Huh7細胞惡性轉化,首先應用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對Huh7-HBx細胞中CDC42基因進行編輯,檢測CDC42基因敲除前后細胞的增殖能力、凋亡水平及遷移能力,而后采用CDC42蛋白特異性抑制劑CASIN處理Huh7-mock細胞和Huh7-HBx細胞,了解其對細胞增殖及凋亡水平的影響。結果發(fā)現(xiàn)：(1)獲得在CDC42基因第二外顯子處具有4個堿基缺失的突變體細胞(Huh7-HBx CDC42 KO);(2)Huh7-HBx CDC42 KO細胞增殖能力顯著低于Huh7-HBx細胞(p0.01)；(3)Huh7-HBx CDC42 KO細胞群體中晚期凋亡細胞比例升高,即細胞抗凋亡能力顯著下降；(4)Huh7-HBx CDC42 KO細胞的遷移能力低于Huh7-HBx細胞；(5)不同濃度CASIN處理一定時間后,Huh7-HBx細胞的增殖能力顯著降低(p0.01),而Huh7細胞的增殖能力沒有顯著變化；Huh7-HBx細胞的抗凋亡能力顯著下降(pO.01),而Huh7細胞抗凋亡能力在抑制劑處理前后沒有顯著變化。3.CDC42參與HBx介導Huh7細胞惡性轉化的定量蛋白質組研究為了鑒定參與HBx介導Huh7細胞惡性轉化的CDC42蛋白下游效應因子,利用基于質量虧損的準等重二甲基標記技術分別對Huh7-mock細胞和Huh7-HBx細胞的全蛋白在肽段水平進行化學標記,混合后的肽段經離線液相分離,Q Exactive HF質譜儀進行質譜檢測,pFind3.0搜索引擎處理數(shù)據。結果顯示：(1)在Huh7-HBx(30L)和Huh7-HBx CDC42 KO (30H)組數(shù)據中,共定量到4436個蛋白,其中差異蛋白為523個,上調蛋白為239個,下調蛋白共284個；(2)下調蛋白的功能主要聚集在細胞死亡、細胞凋亡等途徑；(3)IQGAP1蛋白作為CDC42的下游效應因子可能參與了HBx介導的Huh7細胞惡性轉化。以上研究結果表明,HBx進入Huh7細胞后,通過調控CDC42蛋白活性,使其與IQGAP1結合,導致Huh7細胞的分裂、增殖等生命活動發(fā)生紊亂,最終導致了Huh7細胞惡性化程度的升高。本研究結果提示HBx/CDC42/IQGAP1信號通路在HBx誘發(fā)肝細胞惡性轉化中可能具有重要作用,也許是HBV致癌的一種新機制。
【關鍵詞】：HBx CDC42 IQGAP1 細胞惡性轉化 定量蛋白質組學
【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R512.62;R735.7
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-13
• 中英文縮略詞表13-15
• 第一篇 文獻綜述15-24
• 第一章 乙型肝炎病毒X蛋白在肝細胞癌中的作用研究進展16-20
• 1. HBx與HBV基因組的復制與表達16-17
• 2. HBx與肝細胞癌17
• 3. HBx與細胞凋亡17-19
• 3.1 HBx促進細胞凋亡18
• 3.2 HBx抑制細胞凋亡18-19
• 4. HBx與肝細胞惡性轉化19-20
• 第二章 CDC42在癌癥中作用的研究進展20-22
• 1. CDC42與細胞侵襲、轉移20-21
• 2. CDC42與細胞極性21-22
• 3. CDC42在癌癥中的作用22
• 目的及意義22-24
• 第二篇 研究內容24-60
• 第一章 HBx基因介導人肝癌細胞系Huh7細胞惡性轉化25-35
• 前言25
• 1. 實驗材料與方法25-31
• 1.1 實驗材料25-28
• 1.2 實驗方法28-31
• 2. 結果與分析31-33
• 2.1 HBx基因在Huh7細胞中的表達水平31
• 2.2 HBx介導Huh7細胞惡性轉化31-33
• 3. 討論33-34
• 4. 小結34-35
• 第二章 HBx介導的Huh7細胞惡性轉化依賴CDC42蛋白35-50
• 前言35
• 1. 實驗材料與方法35-42
• 1.1 實驗材料35-36
• 1.2 實驗方法36-42
• 2. 結果與分析42-48
• 2.1 gRNA與CRISPR/Cas9載體連接42
• 2.2 gRNA內源活性檢測42-44
• 2.3 單克隆分選與鑒定44
• 2.4 CDC42基因敲除對Huh7-HBx細胞表型的影響44-46
• 2.5 CDC42蛋白活性在HBx介導Huh7惡性轉化中的作用46-48
• 3. 討論48-49
• 4. 小結49-50
• 第三章 CDC42參與HBx介導的肝細胞惡性轉化的定量蛋白組學研究50-60
• 前言50
• 1. 實驗材料與方法50-54
• 1.1 實驗材料50-51
• 1.2 實驗方法51-54
• 2. 結果與分析54-58
• 2.1 質譜樣品的制備54-55
• 2.2 二甲基化標記效率分析55
• 2.3 定量蛋白質組學數(shù)據分析55-56
• 2.4 CDC42下游蛋白IQGAP1蛋白表達下調56-58
• 3. 討論58-59
• 4. 小結59-60
• 全文總結60-61
• 參考文獻61-70
• 附表70-83
• 致謝83-85
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表論文85

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據庫 前10條

1 丁志山，，沃興德;細胞調亡與動脈粥樣硬化[J];中國動脈硬化雜志;1998年01期

2 李妍;紀朋艷;張巍;彭順利;呂士杰;;柴胡皂苷d對SH-SY5Y細胞ERK蛋白表達及凋亡的影響[J];中國醫(yī)科大學學報;2013年12期

3 嚴銀芳,陳曉,楊小清,閆遠芳;流行性腮腺炎病毒減毒株S_(79)在幾株腫瘤細胞和正常細胞中增殖的比較研究[J];腫瘤;2003年06期

4 劉功讓;管培中;宋淑亮;逯素梅;馮玉新;辛華;;絞股藍多糖對四氯化碳損傷HepG2細胞的保護作用[J];山東醫(yī)藥;2007年31期

5 肖東杰,汪運山;B細胞被動凋亡的研究進展[J];國外醫(yī)學(臨床生物化學與檢驗學分冊);1998年05期

6 張運濤,劉凡,姜茹,谷仲平,汪涌,張順,劉榮福,李玉梅;外源性p27與GRC-1細胞端粒酶活性及細胞凋亡關系的實驗研究[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志;2002年09期

7 石和元;王平;胡永年;邱幸凡;田代志;;溫膽湯改良方對Aβ_(25-35)誘導AD細胞模型bcl-2、bax蛋白表達的影響[J];世界科學技術;2005年06期

8 孟威宏;王強;王虹蛟;顏煒群;;牛胰蛋白酶抑制劑研究進展[J];國外醫(yī)學(老年醫(yī)學分冊);2008年04期

9 鐘民濤;王曉麗;李星云;劉磊;劉穎麗;張偉;黃敏;;香菇C91-3菌絲發(fā)酵蛋白對H22腫瘤細胞體內外抗腫瘤機制的初探[J];中國微生態(tài)學雜志;2011年09期

10 張晨,黃世林,馬東初,孫英慧,馬小鋒;硫化砷誘導NB_4細胞調亡[J];白血病;2000年06期

中國重要會議論文全文數(shù)據庫 前10條

1 鄒萍;;血液系統(tǒng)惡性腫瘤細胞來源膜微粒的特征及生物學作用研究[A];第13屆全國實驗血液學會議論文摘要[C];2011年

2 蔣爭凡;卞婕;翟中和;;非細胞體系誘導小鼠肝細胞核凋亡的超微觀察[A];第十次全國電子顯微學會議論文集（Ⅰ）[C];1998年

3 陳衛(wèi)銀;祝彼得;劉福友;馮雪梅;;參芎滴丸對急性腦梗死模型大鼠神經細胞調亡的影響[A];中華醫(yī)學會第十三次全國神經病學學術會議論文匯編[C];2010年

4 謝晶日;李威;梁國英;楊豐源;;胃靈顆粒對胃癌前病變細胞調亡基因影響的實驗研究[A];中華中醫(yī)藥學會脾胃病分會第十八次學術交流會論文匯編[C];2006年

5 綦淑芬;萬瑞香;姚如勇;;扇貝多肽對Hela細胞在紫外線損傷下的保護作用[A];第五屆全國自由基生物學與自由基醫(yī)學學術討論會論文摘要匯編[C];2000年

6 吳李君;裴蓓;王順昌;王軍;湯明禮;;砷和鎘暴露誘導秀麗小桿線蟲生殖腺細胞調亡及其信號通路研究[A];中國毒理學會第二屆全國中青年學者科技論壇會議論文集[C];2007年

7 余珂;王敬賢;周炳升;;多溴聯(lián)苯醚誘導人神經SK-N-SH細胞調亡的機理[A];湖北省暨武漢市生物化學與分子生物學學會第八屆第十七次學術年會論文匯編[C];2007年

8 冉新澤;鄭懷恩;王艾平;王鋒超;韓京;;他汀對內皮細胞輻射損傷組織因子與細胞調亡的影響[A];中國毒理學會放射毒理專業(yè)委員會第七次、中國毒理學會免疫毒理專業(yè)委員會第五次、中國環(huán)境誘變劑學會致突專業(yè)委員會第二次、中國環(huán)境誘變劑學會致畸專業(yè)委員會第二次、中國環(huán)境誘變劑學會致癌專業(yè)委員會第二次全國學術會議論文匯編[C];2008年

9 崔承彬;閆少羽;蔡兵;趙慶春;姚新生;曲戈霞;;黑果黃皮Clausena dunniana Levl中咔唑生物堿類新細胞周期抑制劑及細胞調亡誘導劑的核磁共振研究[A];第十一屆全國波譜學學術會議論文摘要集[C];2000年

10 吳耀輝;鄒萍;;Sunrivin基因沉默對K562細胞調亡影響的研究[A];第11次中國實驗血液學會議論文匯編[C];2007年

中國重要報紙全文數(shù)據庫 前1條

1 張?zhí)锟?細胞調亡的意義[N];中國人口報;2002年

中國博士學位論文全文數(shù)據庫 前10條

1 羅曉明;載藥聚合物超細纖維作為腫瘤局部制劑的研究[D];西南交通大學;2014年

2 王石;黃芪甲苷促進血管新生的分子機制研究[D];南京中醫(yī)藥大學;2013年

3 宋楊;抗CD25單抗對腎移植患者調節(jié)性T細胞生存和功能改變影響的研究[D];復旦大學;2014年

4 羅忠光;CRL E3泛素連接酶靶向新藥MLN4924在體內外殺傷肝癌細胞的作用及機制研究[D];復旦大學;2014年

5 肖林林;巨噬細胞對血管細胞的輻射旁效應及其分子機制研究[D];復旦大學;2014年

6 張峰;戊型肝炎病毒基因4型在PLC/PRF/5細胞中的培養(yǎng)及其特征研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2014年

7 陳鳳華;Tat-SmacN7融合肽對腫瘤細胞輻射增敏作用的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2013年

8 虞志新;Th17/Treg失衡及其與中性粒細胞相互影響在ARDS發(fā)病中的作用和機制研究[D];江蘇大學;2015年

9 黃凌燕;STK33基因在下咽鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制研究[D];山東大學;2015年

10 袁媛;let-7c介導c-Myc基因調控逆轉肝癌細胞多藥耐藥的機制研究[D];蘭州大學;2015年

中國碩士學位論文全文數(shù)據庫 前10條

1 張曉嬌;天然抗氧化劑對乳腺癌MCF-7/ADM細胞的耐藥逆轉作用及機制研究[D];河北聯(lián)合大學;2014年

2 呂超紹;重組人干擾素γ(rhIFN-γ)對白血病K562細胞免疫逃逸的影響[D];昆明理工大學;2015年

3 汪建陽;Ang-(1-7)通過G蛋白偶聯(lián)受體Mas對人肝癌HepG2細胞的影響研究[D];廣西醫(yī)科大學;2015年

4 任志濤;小檗堿對TGF-β1誘導A549細胞上皮間質轉化和MRC-5細胞轉分化及細胞信號通路相關蛋白的影響[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2015年

5 楊曉姍;重組人p66Shc腺病毒和賴氨藤黃酸鹽對腫瘤細胞的抑制作用及機制[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2015年

6 萬愛英;大分割照射生物效應實測數(shù)據與LQ公式計算數(shù)據的比較研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2015年

7 邢曉萌;白藜蘆醇對肺癌A549細胞的放射增敏作用及其機制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2015年

8 曹曰針;胞外泛素對Treg細胞免疫抑制活性的影響[D];復旦大學;2014年

9 張曉威;OSW-1與線粒體DNA缺失對肝癌細胞PI3K信號通路的影響[D];延邊大學;2015年

10 余長松;胰高血糖素樣肽-2對IPEG-J2細胞緊密連接表達與屏障功能的影響及其分子機制研究[D];四川農業(yè)大學;2014年

本文編號：920020